抑制ATM/PI3K功能区表达对鼻咽癌细胞CNE1辐射增敏的研究

背景与目的:共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasiamutant,ATM)与细胞辐射敏感性密切相关,已有报道,ATM蛋白(ATM基因编码产物)表达抑制可引起多种恶性肿瘤细胞辐射敏感性的改变。本研究观察ATM/PI3K区反义RNA对鼻咽癌细胞系CNE1ATM蛋白的抑制作用及辐射增敏作用。方法:构建含反义ATM/PI3K区序列逆转录病毒重组体pDOR-atm,经阳离子脂质体转染入CNE1细胞,并命名为CNE1/pDOR-atm。应用半定量RT-PCR法分析反义组和对照组细胞中ATMmRNA的水平,应用流式细胞仪检测表达ATM蛋白的阳性细胞百分率及平均荧光强度,应用集落形成实验及线性二次模型(linear-quadraticmodel,L-Q模型)检测细胞辐射敏感性的变化。结果:在反义组细胞CNE1/pDOR-atm中ATMmRNA指数(mRNAindex,RI)平均为0.23±0.02,在对照组细胞CNE1/pDOR中RI平均为0.51±0.03(P<0.05)。在反义组中ATM蛋白阳性细胞百分率平均为70.8%,ATM蛋白平均荧光强度为1.81±0.12;而对照组中分别为99.3%,4.51±0.18(P<0.01),提示反义组细胞中ATMmRNA水平及蛋白表达抑制。反义组细胞α值为0.40Gy-1,对照组为0.36Gy-1,2Gy辐射增敏比达3.0,提示反义组细胞辐射敏感性增加。结论:抑制CNE1细胞的ATM/PI3K区表达可以达到有效的辐射增敏目的。

抑制ATM表达致鼻咽癌细胞CNE1辐射增敏的细胞周期阻滞研究

背景与目的:细胞周期调控是决定细胞辐射敏感性的决定性因素之一。共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutant,ATM)功能与细胞DNA损伤修复、细胞周期检查点调控密切相关。我们前期研究通过反义RNA抑制ATM基因表达可增加鼻咽癌细胞系CNE1辐射敏感性,本研究拟探讨其辐射增敏的细胞周期阻滞调控机制。方法:ATM反义组细胞CNE1/pDOR-atm及对照组细胞CNE1/pDOR经2Gy、5GyX线照射后不同时间点(1h、4h、8h、24h、48h)收获,应用流式细胞仪(flowcytometer,FCM)检测各细胞周期百分比及凋亡率。结果:两组细胞X线照射后均未出现明显G1期阻滞和细胞凋亡,但分别在照射后1h、4h、8h出现明显S期阻滞,24h、48h出现明显G2期阻滞,其中反义组S期细胞百分率总均数水平低于对照组(P<0.05),而G2/M期细胞百分率总均数水平高于对照组(P<0.05)。结论:反义RNA抑制ATM表达致CNE1辐射增敏的细胞周期调控机制可能与减少S期细胞比例,增加G2/M期细胞比例有关,与G1期阻滞和细胞凋亡的调控无关。

苦参碱改构体X调控Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9蛋白表达诱导人鼻咽癌CNE1凋亡的研究

目的研究苦参碱改构体X体外诱导人鼻咽癌CNE1细胞凋亡的机制。方法用不同剂量改构体X处理CNE1细胞48h,透射电镜观察CNE1细胞超微结构变化;Westernblot检测改构体X对CNE1细胞内Caspase-3,-8,-9蛋白表达的影响。结果苦参碱改构体X作用CNE1 48 h后,细胞出现皱缩,核内异染色质明显增多,核周隙增大,凋亡小体形成等细胞凋亡特征形态,高剂量组较低剂量组细胞凋亡程度更加明显;Western blot检测显示,与阴性对照组相比,除低剂量改构体X对Caspase-8无上调作用外,其他剂量组可上调凋亡相关蛋白Caspase-3,-8,-9的表达(P<0.01),且具有剂量依赖性。结论苦参碱改构体X可通过上调促凋亡蛋白Caspase-3,-8,-9的表达诱导CNE1细胞凋亡。

三氧化二砷诱导鼻咽癌CNE1细胞凋亡及其作用机制的实验研究

目的研究三氧化二砷(As2O3)诱导人鼻咽癌细胞株凋亡作用及其相关机制。方法采用流式细胞术、电镜、TUNEL方法检测As2O3诱导CNE1细胞凋亡作用,免疫组织化学法检测As2O3对CNE1细胞p53、bcl-2和bax蛋白表达的影响。结果经As2O3处理的CNE1细胞发生凋亡,表现为FCM可检测到“亚二倍体峰”,形态学上可见核固缩,染色质边集,凋亡小体形成等改变;TUNEL法可检测到细胞内呈棕色颗粒的凋亡细胞,随着药物浓度升高,凋亡细胞发生率逐渐增多,As2O3目浓度为0.5mg/L、1.0mg/L和2.0mg/L作用48h后,CNE1细胞的凋亡指数分别为2.66±0.64、8.15±0.96和11.59±0.68,显著高于非药物处理组(0.43±0.43,P<0.05)。经As2O3处理的CNE1细胞内p53和bax蛋白表达较对照组明显增加,与凋亡指数呈正相关关系(r=0.554,P=0.011;r=0.891,P=0.000…);p53和bax蛋白表达也呈正相关关系(r=0.626,P=0.003)。结论As2O3在体外可诱导鼻咽癌CNE1细胞凋亡,其机制可能与上调p53、bax基因表达有关。

NP9对鼻咽癌细胞系CNE1基因表达谱的影响

目的:确定NP9表达对鼻咽癌CNE1细胞基因表达谱的影响。方法:稳定表达NP9基因和稳定转染空载体的CNE1细胞分别作为基因芯片分析的实验组和对照组,用高通量的基因芯片筛选实验组细胞的差异表达基因,荧光定量逆转录PCR验证部分基因表达差异。结果:所分析的14500个基因中,266个检测出有表达差异,其中82个基因呈现表达上调(RA>1),184个基因显示表达下调(RA<1)。显著上调和下调的基因分别为34个(RA>1.5)和75个(RA<1.5)。结论:NP9基因的表达导致了CNE1细胞中与细胞周期调控、细胞增殖和分化、细胞信号转导、细胞黏附相关基因表达的改变,为NP9的功能及分子机制研究提供了新的线索。

鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中EBV-LMP 1的表达

目的:探讨人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中EB病毒编码的LMP 1基因表达情况。方法:用免疫组化法及Western bolt法分别检测鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中LMP 1基因的表达情况。结果:免疫组化及Western bolt法均显示,CNE2Z细胞中LMP 1呈强阳性表达,而CNE1细胞中LMP 1呈阴性表达。结论:人高分化鼻咽癌细胞系CNE1中没有LMP 1的表达而人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中LMP 1呈阳性表达,鼻咽癌的恶性程度可能与LMP 1的表达有关。

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌CNE1细胞增殖的影响

目的探讨EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对人高分化鼻咽癌CNE1细胞增殖的影响。方法采用电穿孔基因转染技术。将带有绿色荧光蛋白GFP报道系统的EB病毒LMP1基因真核表达质粒导入CNE1,以载体质粒转染及CNE1细胞为对照组,用免疫组化检测LMP1蛋白的表达;用细胞体外增殖实验检测细胞OD比值;用裸小鼠成瘤实验观察移植瘤体积倍增时间和生长率。结果内动物实验细胞移植后CNE1GL组潜伏期缩短,第7、8、9周时,其平均肿瘤体积生长显著高于对照组(P<0.05);体外细胞增殖实验3组细胞OD比值差异无显著性(P>0.05)。结论EBV-LMP1对CNE1细胞的体内增殖能力可能有促进作用。

PPAR-γ对人鼻咽癌CNE1/DDP细胞顺铂耐药性的逆转作用及其机制探讨

目的观察氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)对人鼻咽癌CNE1/DDP细胞顺铂耐药性的逆转作用,并探讨其机制。方法将CNE1/DDP细胞分别加入10、20μg/mL PPAR-γ激动剂罗格列酮和等体积培养液进行培养。采用MTS法检测细胞耐药逆转率,流式细胞术检测细胞凋亡率和P-糖蛋白(P-gp)表达,RT-PCR法和Western blot法检测多重耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白基因(MRP)和B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)mRNA和蛋白表达,Western blot法检测磷酸化Akt蛋白(p-Akt)。结果加入等体积培养液和10、20μg/mL罗格列酮的CNE1/DDP细胞耐药逆转率分别为100.0%、149.3%±11.3%、293.8%±25.5%,其细胞凋亡率依次升高,PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA和蛋白表达以及p-gp阳性率、p-Akt表达依次降低;两两比较,P均<0.05。结论 PPAR-γ对CNE1/DDP细胞的顺铂耐药性具有逆转作用,且呈剂量依赖性;可能与其抑制Akt磷酸化和耐药基因MDR1、MRP表达,并促进细胞凋亡有关。

鼻咽癌CNE1细胞株中EB病毒LMP1 cNDA的克隆及LMP1胞外段稳定性研究

目的:克隆鼻咽癌细胞株CNE1中EBV-LMP1 cDNA,载入质粒载体pGEM中,并检测CNE1细胞株LMP1胞外肽段表达的稳定性。方法:运用免疫组化的方法检测CNE1细胞潜伏膜蛋白(LMP1)的表达情况,通过RT-PCR技术从CNE1细胞中扩增EBV-LMP1基因全长,并载入质粒载体pGEM,转化JML09菌.提取质粒,利用引物上的BamH1与Hind3酶切位点限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增CNE1细胞中含有LMP1三段胞外段的序列并测序。结果:免疫组化显示CNE1细胞高表达LMP1,扩增的LMP1 cDNA长度为1158bp,测序结果与已知序列有部分变异。连续传代的CNE1细胞LMP1胞外段表达稳定。结论:成功克隆了EBV-LMP1 cDNA,并载入质粒载体,证实LMP1胞外段表达稳定,为研究LMP1在鼻咽癌致病机制中的作用,并进一步研制LMP1胞外段特异性单克隆抗体,为其在鼻咽癌放疗靶区功能显像的研究中奠定基础。

二烯丙基二硫诱导人鼻咽癌CNE1细胞凋亡

目的探讨二烯丙基二硫(DADS)诱导人鼻咽癌CNE1细胞凋亡的生物学效应。方法通过MTT法检测DADS对CNE1细胞生长的影响;用光学显微镜、流式细胞仪研究DADS诱导细胞凋亡的作用。免疫组织化学法检测细胞内Bcl-2、Bax蛋白的表达,Western blot法检测细胞内Caspase-3蛋白的表达。结果DADS能抑制CNE1细胞的生长。DADS处理CNE1细胞后,细胞呈凋亡特征性改变。流式细胞分析显示DADS呈浓度依赖性诱导CNE1细胞凋亡。免疫组织化学结果表明DADS处理细胞后,Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下降。随药物浓度的增加Caspase-3蛋白表达增强。结论DADS具有诱导CNE1细胞凋亡的作用,其机制可能与Bcl-2/Bax下降,促进Caspase-3活化有关。

miRNA-325-3p通过下调细胞角蛋白13的表达降低鼻咽癌细胞CNE1的放疗敏感性

目的:探究miRNA-325-3p及其靶基因细胞角蛋白13(cytokeratin 13,CK13)对鼻咽癌细胞CNE1的放疗敏感性的影响。方法:通过miRBase、Targetscan及Microcosm三大数据库预测miRNA-325-3p的潜在靶基因,并通过双荧光素酶活性检测实验进行验证,qPCR检测不同放射剂量下鼻咽癌细胞CNE1中miRNA-325-3p及其靶基因的表达水平变化,通过克隆形成实验观察不同放射剂量下过表达miRNA-325-3p及敲低靶基因后CNE1细胞克隆形成率的变化,流式细胞术验证过表达miRNA-325-3p及敲低靶基因后CNE1在不同放射剂量下凋亡水平的变化,MTT法检测miRNA-325-3p过表达和CK13敲低组鼻咽癌细胞CNE1在不同放射剂量下的细胞存活率以验证其放疗敏感性的变化。结果:CK13确认为miRNA-325-3p的潜在靶基因,鼻咽癌细胞CNE1经放射处理后,miRNA-325-3p的表达水平显著升高、CK13的表达水平显著降低(均P<0.05)。miRNA-325-3p表达量上调和CK13基因沉默均显著提高CNE1细胞的存活率[miRNA上调时(:60.14±3.55)%vs(19.23±3.42)%,t=14.37、P<0.01;CK13沉默时:(76.15±5.13)%vs(28.53±3.68)%,t=13.06、P<0.01]和克隆形成率,降低了凋亡率[miRNA上调时:(27.95±2.67)%vs(51.68±3.47)%,t=9.39、P<0.01;CK13沉默时:(20.31±2.62)%vs(38.14±3.83)%,t=6.66、P<0.01]。结论:miRNA-325-3p能够通过下调靶基因CK13的表达降低鼻咽癌细胞CNE1对放疗的敏感性。

染料木素对人鼻咽癌CNE1细胞生长的抑制作用及靶点预测

目的:研究染料木素对人鼻咽癌CNE1细胞生长的抑制作用并预测其可能的作用靶点。方法:采用CCK-8法检测0(空白对照)、12.5、25、50、100、150μmol/L染料木素分别作用24、48、72 h对CNE1细胞增殖的影响;分别采用流式细胞术检测0(空白对照)、15、30、60μmol/L染料木素作用24 h对CNE1细胞周期、凋亡的影响;采用划痕实验检测0(空白对照)、10、20、30μmol/L染料木素作用24 h对CNE1细胞迁移能力的影响。采用高通量测序法挖掘0(空白对照)、30μmol/L染料木素作用24 h后CNE1细胞中的差异基因,并通过实时荧光定量-聚合酶链式反应法(RT-qPCR)对上述细胞实验相关差异基因mRNA的表达情况进行验证。结果:与空白对照比较,12.5、25、50、100、150μmol/L染料木素对细胞的增殖均有显著的抑制作用(P<0.01),且呈浓度-时间-效应趋势;15、30μmol/L染料木素可使细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05或P<0.01),30、60μmol/L染料木素可使细胞周期阻滞于G2/M期并显著促进其凋亡(P<0.05或P<0.01);10、20、30μmol/L染料木素可显著抑制细胞的迁移能力(P<0.01)。高通量测序共挖掘出2271个差异基因(padj<0.05),其中1154个基因上调、1117个基因下调;结合细胞实验结果共筛选出p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、PI3K、AKT等8个潜在靶点差异基因。经RT-qPCR法验证,其中p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、AKT等7个潜在靶点差异基因mRNA的表达均显著下调(P<0.05),与转录组测序结果基本一致。结论:染料木素能有效抑制人鼻咽癌CNE1细胞的生长;其抗鼻咽癌机制可能与抑制突变型p53基因的表达,恢复野生型P53蛋白功能以及抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路的活性有关。

高丽槐素对鼻咽癌CNE1细胞增殖、迁移、凋亡的影响及机制

目的:探讨高丽槐素对鼻咽癌(NPC)细胞CNE1增殖、单克隆、迁移和凋亡的影响及潜在的作用靶点。方法:将培养的CNE1细胞随机分为空白对照组和高丽槐素给药组。采用CCK8法检测不同浓度的高丽槐素作用24 h、48 h、72 h后的增殖抑制率,单克隆试验检测各组细胞的克隆形成能力,细胞划痕试验检测各组细胞迁移能力,流式细胞术试验检测细胞的凋亡情况,利用高通量测序技术,分析CNE1细胞转录组的变化,得到差异表达基因,筛选潜在基因靶点,采用反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行验证。结果:CCK8结果显示,高丽槐素能显著抑制CNE1细胞的增殖,且具有时间和浓度依赖性(P<0.05);与对照组比较,高丽槐素能抑制CNE1细胞的克隆能力和迁移能力(P<0.05),且CNE1细胞克隆形成能力与迁移能力随着高丽槐素浓度的增加而减弱;Annexin V-FITC/PI染色结果显示,高丽槐素可使CNE1细胞凋亡率升高(P<0.05);高通量测序结果显示,共有4 232个差异表达基因,表达程度显著升高的基因数有1 060个,表达程度显著降低的基因数有3 172个,高丽槐素可使抑癌基因(P53)、细胞周期依赖激酶抑制剂(P21)、成纤维细胞生长因子(Fgf2)、磷脂酰肌醇3-激酶(Pi3k)、丝裂原活化蛋白激酶8(Mapk8)等基因下调(P<0.05);RT-qPCR显示高丽槐素能下调P53、P21、Fgf2、Pi3k、Mapk8 mRNA表达水平(P<0.05),检测结果显示与测序结果相一致。结论:高丽槐素可抑制CNE1细胞的增殖、克隆与迁移能力并促进细胞凋亡,其作用机制可能与P53、P21、Fgf2、pi3k、Mapk8等多组基因的转录变化有关。

紫草素对鼻咽癌CNE1细胞免疫逃逸的影响

【目的】探讨紫草素对鼻咽癌细胞的治疗作用及机制。【方法】(1)体外研究:将人鼻咽癌CNE1细胞分为阴性对照组,紫草素1.2、2.4、3.6μmol/L组及紫杉醇2.5μmol/L组。采用四甲基偶氮唑盐(MMT)法检测CNE1细胞活性,Hoechst法检测CNE1细胞凋亡情况,Western Blot法检测CNE1细胞叉头样转录因子3(Foxp3)、维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)蛋白表达。(2)体内研究:将48只裸鼠分为正常组,模型组,紫草素低、中、高剂量组及紫杉醇组,每组8只。除正常组外,其余各组裸鼠建立鼻咽癌模型。紫草素低、中、高剂量组分别给予1.0、2.0、3.0 mg/kg紫草素灌胃,紫杉醇组腹腔注射2.0 mg/kg的紫杉醇。测量瘤体质量,计算抑瘤率,提取巨噬细胞采用流式细胞仪检测程序性死亡受体1配体(PD-L1)表达,Western Blot法检测Foxp3、RORγt蛋白表达。【结果】与阴性对照组比较,紫草素1.2、2.4、3.6μmol/L组及紫杉醇2.5μmol/L组的细胞活性均降低,细胞凋亡率增加(均P<0.05),并存在紫草素浓度依赖性,且Foxp3蛋白表达水平升高、RORγt蛋白表达水平降低(均P<0.05)。与正常组比较,模型组裸鼠巨噬细胞中PD-L1、肿瘤组织RORγt蛋白表达水平升高,肿瘤组织Foxp3蛋白表达水平降低(均P<0.05);与模型组比较,紫草素低、中、高剂量组及紫杉醇组肿瘤质量减小,PD-L1、RORγt蛋白表达水平降低,Foxp3蛋白表达水平升高(均P<0.05);紫草素高剂量组各指标与紫杉醇组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。【结论】紫草素可以抑制鼻咽癌细胞增殖,抑制瘤体生长,其机制可能与降低肿瘤微环境巨噬细胞的PD-L1活性,激活Foxp3并抑制RORγt表达,进而减少肿瘤细胞免疫逃逸有关。

ZnPcH_1-PDT对鼻咽癌CNE1细胞杀伤作用的实验研究

目的探讨新型酞菁类光敏剂锌酞菁H1(ZnPcH1)介导的光动力疗法(ZnPcH1-PDT)对鼻咽癌CNE1细胞的杀伤作用。方法采用人鼻咽癌CNE1细胞作为研究对象,应用MTT比色法和细胞集落形成实验检测PDT对CNE1细胞增殖的影响,采用AO/EB荧光染色法、TUNEL、DNA倍体分析检测细胞的死亡方式。结果MTT比色法及细胞集落形成实验结果显示,ZnPcH1-PDT可抑制鼻咽癌CNE1细胞增殖抑制率,并随ZnPcH1的增加而增高(P<0.05);AO/EB荧光染色法、TUNNEL、DNA倍体分析结果均表明ZnPcH1-PDT能够诱导CNE1细胞凋亡,凋亡率呈时间依赖性。结论ZnPcH1-PDT能够有效地抑制鼻咽癌CNE1细胞增殖,诱导该细胞凋亡,拥有良好的应用前景。

siRNA干扰KLF8表达对鼻咽癌细胞上皮间质转化的作用

目的探讨下调KLF8的表达对鼻咽癌CNE1-LMP1细胞侵袭能力的影响及其机制。方法通过脂质体转染法将KLF8 siRNA真核表达质粒稳定转染至鼻咽癌细胞株CNE1-LMP1。Western blot和RT-PCR法检测CNE1-LMP1细胞中KLF8、E-cadherin、N-cadherin蛋白和m RNA表达水平的变化。Transwell侵袭实验观察siRNA后对CNE1-LMP1细胞侵袭能力的影响。结果 KLF8 siRNA转染的CNE1-LMP1细胞株与其阴性对照NC-si组比较KLF8蛋白和mRNA表达水平均下调,证实稳转细胞株建立成功。KLF8 siRNA可上调CNE1-LMP1细胞中E-cadherin的表达,而下调N-cadherin的表达。Transwell侵袭实验显示siRNA干扰CNE1-LMP1细胞侵袭能力下降。结论 KLF8在鼻咽癌CNE1-LMP1细胞中高表达;通过siRNA下调KLF8的表达能干扰上皮间质转化(EMT)相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达,阻断EMT过程,抑制CNE1-LMP1细胞侵袭转移。

EB病毒潜伏膜蛋白1通过蛋白激酶C调节AnnexinⅠ的丝氨酸磷酸化

背景与目的:在利用磷酸化蛋白质富集结合蛋白质组学技术分析EB病毒潜伏膜蛋白1(latent membrane protein1,LMP1)调节的磷酸化蛋白质分子时,我们发现了包括AnnexinⅠ在内的25个新的受EB病毒LMP1调节的磷酸化蛋白质分子。本实验探讨LMP1调节AnnexinⅠ磷酸化的信号通路。方法:采用鼻咽癌细胞系CNE1和LMP1稳定表达的细胞系CNE1-LMP1,Western blot检测AnnexinⅠ的蛋白表达水平;免疫沉淀结合Western blot检测AnnexinⅠ的丝氨酸和酪氨酸磷酸化;激酶分析实验检测蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的活性。结果:LMP1对AnnexinⅠ的蛋白表达水平没有影响,LMP1上调AnnexinⅠ的丝氨酸磷酸化水平,而对酪氨酸磷酸化水平没有影响。在CNE1细胞中PKC的相对活性为0.97±0.05,CNE1-LMP1细胞中的PKC相对活性为1.22±0.10,CNE1与CNE1-LMP1细胞之间PKC的活性差异有统计学意义(P<0.01,n=6),表明LMP1可以上调PKC活性。AnnexinⅠ的丝氨酸磷酸化水平随PKC活性的变化而变化。结论:EB病毒LMP1通过PKC信号通路调节AnnexinⅠ丝氨酸磷酸化。

萤光素酶报告基因细胞模型在筛选靶向调控RAC1的大黄酸衍生物中的应用

目的 构建含RAC1启动子萤光素酶报告基因CNE1-RAC1-Luc2稳转细胞模型,探讨其在转录水平筛选靶向调控RAC1抗肿瘤活性的大黄酸衍生物中的应用。方法 利用RAC1启动子序列,设计合成萤光素酶报告基因-慢病毒重组载体,感染鼻咽癌CNE1细胞,获得稳定表达萤光素酶的细胞;采用萤光素酶报告基因检测试剂盒,检测RAC1激活剂PMA和抑制剂NSC23766刺激该细胞后的萤光素酶发光值,并观察系列大黄酸衍生物对RAC1启动子萤光素酶活性的影响,Western blot验证细胞RAC1蛋白表达的变化。结果 双酶切实验显示,含RAC1启动子萤光素酶报告基因的慢病毒表达载体构建成功;经嘌呤霉素筛选,获稳定表达萤光素酶的CNE1-RAC1-Luc2细胞,转染效率达90%以上;RAC1萤光素酶报告基因检测系统对RAC1激活剂和抑制剂反应灵敏,萤光素酶活性与Western blot实验中RAC1蛋白表达结果一致;系列大黄酸衍生物对CNE1-RAC1-Luc2细胞萤光素酶活性的调控作用与Western blot结果基本一致。结论 成功构建了含RAC1启动子的萤光素酶报告系统的细胞模型,为高通量进行靶向RAC1药物的筛选提供一个实用的平台。

干扰长链编码RNA FOXCUT能抑制鼻咽癌细胞上皮间质转化及诱导线粒体损伤

目的探讨干扰长链编码RNAFOXCUT对鼻咽癌细胞上皮间质转化及线粒体功能的影响。方法RT-PCR检测50例鼻咽癌患者癌组织及癌旁组织和NP69、CNE1、CNE2、SUNE2、HER2和5-8F细胞株中FOXCUT表达水平;将shRNA FOXCUT转染至CNE1细胞,随机分组为Control组、shRNA-NC组和FOXCUT-shRNA3组。采用CCK8法和克隆形成实验检测细胞增殖;显微镜观察细胞形态;免疫荧光检测Vimentin+含量;试剂盒检测氧化应激标记物SOD、MDA、LDH的水平;流式检测线粒体膜电位的变化;Western blot法检测E-cad、N-cad、Vimentin、Bax、Bcl-2、caspase-3和c-Myc蛋白表达水平。结果与癌旁组织相比,鼻咽癌组织中FOXCUT表达水平均升高(P<0.001)。与NP69细胞相比,CNE1、CNE2、SUNE2、HER2和5-8F细胞FOXCUT表达水平均升高(P<0.001)。与Control组相比较,FOXCUT-shRNA3组细胞增殖倍数及克隆形成率降低(P<0.001),细胞形态呈短梭形、扁平型或圆形,细胞间的连接较为紧密,具有铺路石样特征;N-cad、Vimentin的表达水平降低,E-cad的表达水平升高(P<0.05),Vimentin+含量降低(P<0.001),MDA、LDH的含量明显升高(P<0.05),SOD的活性明显降低(P<0.05),红色荧光细胞向绿色荧光细胞转变较明显,绿色荧光细胞百分比增加,Bax/Bcl2、Cleaved cas3/cas3表达显著上升,c-Myc表达显著降低(P<0.001)。结论干扰长链非编码RNAFOXCUT能够抑制鼻咽癌细胞增殖,减少上皮间质转化,增强氧化应激、降低膜电位,诱导CNE1细胞线粒体功能损伤,促进凋亡;干扰长链非编码RNAFOXCUT对CNE1细胞抑制效果显著,具有靶向治疗鼻咽癌的潜力。

苦参碱改构体X对人鼻咽癌CNE1细胞的凋亡诱导作用

目的:探讨苦参碱改构体X体外诱导人鼻咽癌CNE1细胞凋亡的作用与机制。方法:用0,29,58,116,232,464μmol.L-1不同剂量改构体X处理对数生长期CNE1细胞48 h,采用MTT法检测苦参碱改构体X对CNE1细胞增殖的抑制作用,使用流式细胞仪检测改构体X对CNE1凋亡率和细胞周期的影响,Western blot法检测改构体X对CNE1细胞内Bcl-2、Bax及p53等凋亡过程中相关蛋白表达的影响。结果:苦参碱改构体X作用CNE1 48 h后,MTT结果显示,改构体X对CNE1细胞增殖有抑制作用并具有浓度依赖性;流式细胞仪分析结果显示,改构体X 58,116μmol.L-1浓度组细胞凋亡率高出苦参碱组70.02%,75.73%,高于阴性对照组(P<0.05,P<0.01);细胞周期测定结果显示改构体X各剂量组均可不同程度地将CNE1细胞周期抑制在G1期,与阴性对照组相比具差异显著性(P<0.05,P<0.01);Western blot检测表明,苦参碱改构体X作用CNE1 48 h后,凋亡相关蛋白Bcl-2降低,Bax,p53增加,与阴性对照组相比有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:苦参碱改构体X在体外可诱导CNE1细胞凋亡,其促凋亡机制可能与阻滞细胞周期、增加促凋亡蛋白Bax和p53表达并降低抑制凋亡蛋白Bcl-2表达有关。