西藏牦牛mtDNA COⅢ全序列测定及系统进化关系

【目的】探讨西藏牦牛的遗传多样性和类群间的系统进化关系,为西藏牦牛遗传资源的合理保护和利用提供理论依据。【方法】对11个西藏牦牛类群111个个体的mtDNA COⅢ的全序列进行测定,用多种生物信息学软件分析牦牛类群的遗传多样性和它们间的亲缘关系及分类。【结果】①西藏11个牦牛类群的mtDNA COⅢ全序列长度均为781 bp,基因间没有内含子,共编码260个氨基酸,启始密码子AUG(ATG),含一个游离碱基。4种核苷酸的平均比例分别为29.2%(T)、29.4%(C)、26.1%(A)和15.2%(G),有一定的偏倚性。②发现西藏牦牛的mtDNA COⅢ共有18种单倍型,11个牦牛类群的单倍型多样性值在0.378—0.844。表明,西藏牦牛具有较丰富的mtDNA COⅢ遗传多样性。③在mtDNA COⅢ的20种氨基酸组成中,亮氨酸平均含量最多,为11.92%,赖氨酸和半胱氨酸平均含量最少,为0.77%。碱性氨基酸、酸性氨基酸、亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的含量分别为11.15%、4.62%、29.61%和54.61%。④从mtDNA COⅢ来看,西藏11个牦牛类群可分为3大类,即帕里牦牛(PL)系、巴青牦牛(BQ)系、斯布牦牛(SB)系。【结论】西藏牦牛有丰富的遗传多样性,可分为3大类;结果支持将牦牛划分为牛亚科中一个独立属(牦牛属,Poephagus)的观点。

基于线粒体DNA 12S rRNA和COⅢ基因序列研究中国沿海7个长蛸(Octopus variabilis)野生群体的遗传多样性

基于线粒体DNA的12S rRNA和COⅢ基因序列对我国沿海重要经济头足类长蛸不同群体(大连、烟台、青岛、连云港、舟山、温州、厦门)进行了遗传多样性和遗传结构的分析。由PCR扩增获得80个个体的12SrRNA基因416bp、COⅢ基因512bp的部分序列,两者多态性遗传参数统计显示,80个个体分别检出64(12S)和27(COⅢ)个单倍型,总群体单倍型多样性指数(Hd)分别为0.984(12S)和0.909(COⅢ),核苷酸多样性指数(Pi)分别为0.028(12S)和0.034(COⅢ),平均核苷酸差异数(K)分别为9.403(12S)和17.265(COⅢ),显示出较丰富的遗传多样性。两种基因遗传分析结果均显示厦门群体与其它群体的显著分化。初步分析长蛸各群体遗传分化的原因之一可能是洋流格局的形成阻隔了群体间的基因交流。

家鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ(COⅢ)基因的克隆及序列分析

线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的、重要的细胞器,是细胞进行氧化磷酸化的场所。不同脊椎动物同源基因序列的比较显示,细胞色素b(Cytb)、细胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)、细胞色素C氧化酶Ⅱ(COⅡ)、细胞色素C氧化酶Ⅲ(COⅢ)基因最保守,同源性最高,ATPase6、ATPase8基因、ND基因变异比较大。以家鸭(Anas platyrhynchos)肝脏的线粒体DNA为模板,按照GenBank已经公布的潜鸭族(AF090337)的全序列及其绿头鸭的mtDNA部分序列(L22476、L16770、L22477)设计合成特异引物进行PCR扩增,克隆并测定了线粒体细胞色素C氧化酶Ⅲ亚基(COⅢ)的全序列784bp以及ATPase6基因的3′端和tRNA-Gly基因的5′端序列共934bp。用DNAStar分析软件对家鸭与GenBank中7种禽类的COⅢ序列进行比较分析,显示家鸭与这些动物的COⅢ基因具有较高的同源性,与同科潜鸭属中的Aythya americana的相似性最高为90.6%,与同目不同科的加拿大雁、小天鹅、白额雁的相似性分别为89%、88.6%、88.6%。根据家鸭与其他7种禽类的COⅢ基因序列相似性所建立的进化树,与传统的分类地位基本吻合。

基于线粒体COⅢ基因分析厚壳贻贝(Mytilus coruscus)养殖群体遗传多样性

基于线粒体DNA的COⅢ基因序列对我国沿海重要经济贝类厚壳贻贝3个养殖群体(温州、宁德、福州)的遗传多样性和遗传结构进行了分析。由PCR扩增获得23个体的COⅢ基因787bp的部分序列,其多态性遗传参数统计显示,23个个体共检出21个单倍型,总群体单倍型多样性指数(Hd)为0.978,核苷酸多样性指数(Pi)为0.01045,平均核苷酸差异数(K)为8.534,三个群体均显示出较丰富的遗传多样性。遗传分化系数(Fst)表明,福州群体与宁德群体和温州群体间有一定程度的遗传分化,而宁德群体和温州群体间无遗传分化。

线粒体COⅢ基因分析三种常见鲳鱼的亲缘关系

金鲳(Trachinotusovatus)、银鲳(Pampusargenteus)和中间低鳍鲳(Peprilusmedius)是重要经济鱼种,其中后两种鱼外形较为相似,分类一直存在分歧.本研究随机采集烟台、青岛地区银鲳、中间低鳍鲳和金鲳的生鲜海鱼样本,提取3种鱼的全基因组DNA,设计通用引物对目标基因进行PCR扩增和测序,后对其线粒体COⅢ全序列及ATP6部分序列进行基因多态性分析,探讨3种鱼的亲缘关系;依据测序结果,设计各鱼种的特异引物,用特异引物和通用引物进行复合PCR扩增方法对各鱼种进行种源性鉴定.通过比对分析测序结果,获得了中间低鳍鲳COⅢ基因全序列及ATP6基因部分序列且收录在NCBI核苷酸数据库中,登录号分别为KT210112和KT210113.证明NCBIGenBank中发布的刺鲳(Psenopsis anomala)序列(KP334103.1)实为中间低鳍鲳.遗传距离分析发现银鲳与金鲳的距离最大,与中间低鳍鲳次之,中间低鳍鲳与金鲳的遗传距离最小.采用复合PCR方法,实现了在同一复合PCR体系中有效区分3种鱼的方法,具有更加便捷、准确的优势.

基于线粒体COⅢ基因变异鉴定黄渤海地区海鱼种类

本研究根据GenBanK发布的核苷酸数据库信息,设计扩增鱼类线粒体COⅢ基因的通用引物,扩增黄渤海地区7种重要商品海鱼(光鱼、梭鱼、鲫鱼、舌鳎、扒皮鱼、六线鱼、白姑鱼)的COⅢ全长基因序列.对扩增产物进行测序、比对,利用分子生物学软件进行序列酶切分析,最终选用Nla Ⅲ限制性内切酶进行酶切,并获得了所研究的各鱼种的特异酶切片段图谱.结果表明,利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术能有效地区分以上7种海鱼,PCR-RFLP技术应用在鱼种鉴定上具有快速、准确的优势.

中甸牦牛mtDNA ND6和COⅢ基因遗传多样性及系统进化分析

为了解中甸牦牛的遗传多样性,使其遗传资源能够得到合理开发利用,本研究对中甸牦牛15个个体mtDNA ND6基因和COⅢ基因全序列进行测定,使用MEGA5.0、DNASP5.0、Clustal X1.83等软件分析了核苷酸多样性、单倍型多样性等遗传多样性指标。结果表明:(1)中甸牦牛ND6基因全序列长528bp,4种核苷酸T、A、G、C的平均含量为20.8%、42.2%、7.6%、29.4%,存在一定的碱基组成偏倚性;COⅢ基因全序列长度为781bp,4种核苷酸T、A、G、C的平均比例为29.2%、26.1%、15.2%、29.5%。(2)在15个中甸牦牛个体的ND6基因序列中均未发现单倍型及变异位点,表明中甸牦牛mtDNA ND6基因的遗传多样性较为贫乏;在COⅢ基因序列中发现了3个单倍型,4个变异位点,其中2个转换,2个颠换。(3)在构建的系统进化树中,中甸牦牛首先与麦洼牦牛等家牦牛聚为一类,说明其属于家牦牛,其次与野牦牛聚为一类,说明中甸牦牛与野牦牛亲缘关系较近;由遗传距离分析可知,中甸牦牛与野牦牛距离最小,与亚洲水牛距离最大。此结果进一步支持了将牦牛和野牦牛划分为牛亚科牦牛属的观点。

基于COⅢ和HNF-1α序列研究龟鳖类的系统进化特征

用PCR扩增和测序的方法,获得小鳄龟(Chelydra serpentina)的COⅢ和HNF-1α序列,并分别结合NCBI中其他龟鳖的同源性序列进行比对分析。比对后得到757 bp的COⅢ一致序列和769 bp的HNF-1α一致序列。其中,COⅢ一致序列含有可变位点324个,序列总变异率为42.8%,简约信息位点230个;T、C、A、G的平均含量分别为27.5%、26.6%、30.8%、15.1%,A+T含量(58.3%)高于G+C含量(41.7%),转换/颠换比率(R)为2.62。HNF-1α一致序列有变异位点112个,变异率为14.6%,简约信息位点67个;T、C、A、G的平均含量为26.1%、23.1%、28.3%、22.6%,A+T含量为54.4%,G+C含量为45.7%,转换/颠换比率(R)为1.42。基于Kimura双参数模型计算龟鳖类种间、属间、科间遗传距离,并采用邻接法、最大简约法和最大似然法构建分子系统进化树。结果显示:基于COⅢ序列的淡水龟科4个属间的遗传距离为0.090～0.153,平均遗传距离为0.129;曲颈龟亚目5个科之间的遗传距离为0.150～0.207,平均遗传距离为0.177;基于HNF-1α序列的龟科9属间的遗传距离为0.003～0.051,平均为0.016;鳄龟科、龟科、淡水龟科3科间的遗传距离为0.044～0.067,平均为0.053。由遗传距离和构建的系统进化树可知,淡水龟科与陆龟科具有较近的亲缘关系,而与龟科的亲缘关系较远;支持龟科重新划分为两个分支;鳄龟科和海龟科亲缘关系较近,大鳄龟(Macroclemys temminckii)和小鳄龟可能同为一属。

暗纹东方鲀线粒体COIII克隆及序列分析

克隆并测定了暗纹东方鲀线粒体基因组(m tDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ(CO III)及其下游70 bp的tRNAG ly序列。CO III基因编码框包含786个核苷酸,编码262个氨基酸的蛋白质。鱼类CO III的序列组成对A+T核苷酸的偏倚程度比较低。通过暗纹东方鲀与GenBank中8个目12种鱼类的CO III序列同源性比较,显示暗纹东方鲀与这些鱼类的CO III基因具有较高的同源性。根据暗纹东方鲀与鲀目其他5种鱼的CO III基因序列所建立的进化树,与传统的分类地位相吻合。推定的tR-NA的二级结构具有典型的三叶草型结构。根据CO III序列构建的分子进化树分析,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时,应综合考虑物种遗传变异的特点。

紫贻贝(Mytilus edulis)养殖群体的遗传多样性及遗传结构分析

基于线粒体DNA的COⅢ基因序列对我国沿海重要经济贝类紫贻贝3个养殖群体(烟台、乳山、东极)的遗传多样性和遗传结构进行了研究。由PCR扩增获得32个体的COⅢ基因750bp的部分序列,其多态性遗传参数统计显示,32个个体共检出18个单倍型,总群体单倍型多样性指数(Hd)为0.946,核苷酸多样性指数(Pi)为0.0207,平均核苷酸差异数(K)为15.316,三个群体均显示出较丰富的遗传多样性。遗传分化系数(Fst)表明,东极群体与烟台群体及乳山群体已明显分化,而烟台群体和乳山群体间无遗传分化,并且存在着较大的基因流。

一种新型NTC厚膜电阻的制备及电性能研究

以新型BaCoⅡ 0.05CoⅢ0.1Bi0.85O3材料为基体,以CuO为烧结助剂,在790、800、810℃烧结4h制备了NTC厚膜电阻。借助XRD、SEM和阻温特性测试仪,研究了CuO含量对电阻相组成、微观结构及电性能的影响。结果表明：烧结温度为800℃的NTC厚膜电阻主要物相为具有复合立方钙钛矿结构的BaCoⅡ0.05CoⅢ0.1Bi0.85O3,并有少量Bi2O3剩余;该组电阻表面颗粒均匀细小,致密性随CuO含量的增加而趋于增加。对烧结温度为790℃的电阻来说,其室温电阻R25和B25/85随CuO含量的增加而逐渐降低;该电阻的R25、B25/85及活化能Ea分别为0.98-13.40kΩ、931-1855K和0.08-0.16eV。

合成左旋和右旋丙叉甘油醇的新方法

在(R,R)-Salen-CoⅢ催化剂作用下,动力学水解拆分外消旋的环氧氯丙烷,得到S-环氧氯丙烷和R-3-氯-1,2-丙二醇。以S-环氧氯丙烷为原料,通过水解,与丙酮缩合,取代,醇解得到(S)-丙叉甘油醇,总收率为59.4%。通过R-3-氯-1,2-丙二醇合成得到(R)-丙叉甘油醇,总收率为62.5%。产品经1HNMR、MS、IR分析确认。

聚合酶链式反应快速检测畜肉食品中鸭源性成分

目的:建立一种快速、特异、灵敏的鸭源性成分检测方法。方法:以鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ(COⅢ)基因序列为靶位点设计引物,进行聚合酶链式反应扩增,建立鸭源性成分检测方法;以常见畜禽肉,包括羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等参考动物物种进行特异性检测;以50 mg/kg羊肉DNA作为稀释液,对鸭肉DNA进行梯度稀释,检测灵敏度。结果:该方法能够有效的对鸭源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高(0.1μg/kg),且羊肉成分的存在对鸭肉灵敏度检测没有影响,可以快速、准确检测畜肉食品中掺杂的鸭源性成分。

蝉花菌丝对TGF-β_1作用下的肾小管上皮细胞α-SMA等蛋白及mRNA表达的影响

目的:探讨蝉花菌丝对TGF-β1作用下肾小管上皮细胞α-SMA、FN、LN、ColⅢ蛋白及mRNA表达的影响。方法:以TGF-β1剌激下的肾小管上皮细胞为研究对象,采用血清药理学研究方法和免疫组化、RT-PCR检测技术,观察空白对照组、TGF-β1对照组、冬虫夏草组、蝉花高剂量组、蝉花中剂量组和蝉花低剂量组的α-SMA、FN、LN、ColⅢ蛋白及mR-NA表达,采用SPSS11.5统计软件统计分析。结果:TGF-β1剌激下的肾小管上皮细胞α-SMA、FN、LN、ColⅢ蛋白及mRNA的表达与正常组比较明显增加(P<0.01);蝉花大、中、小剂量组均能下调肾小管上皮细胞对α-SMA、LN、FN、ColⅢ蛋白及mRNA的表达,与TGF-β1对照组比较差异有统计学意义(P<0.05～0.01),并且大剂量的蝉花菌丝组优于虫草菌丝组(P<0.05);不同剂量的蝉花菌丝组存在量效依赖关系。结论:本研究表明蝉花菌丝通过下调TGF-β1刺激下的肾小管上皮细胞对α-SMA、LN、FN、ColⅢ蛋白及mRNA的异常表达而发挥抗肾间质纤维化的药理作用。

PCR-mtDNA技术鉴别检测不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分

以鸭肌肉组织DNA为模板,利用PCR-mtDNA技术成功克隆出了鸭mtDNA COⅢ基因(GenBank Accession No.DQ655706)。对所克隆的序列分析表明,其序列包括鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ(COⅢ)基因全序列784 bp,通过同源性分析可知,动物的线粒体DNA COⅢ基因是相对保守的,利用此特性设计PCR-mtDNA方法鉴别检测鸭源性成分的特异性引物;以各种动物肌肉组织及饲料DNA为模板进行PCR扩增、经反复验证筛选出只能扩增出鸭DNA的目的片段,而不能扩增出其他动物DNA片段的特异性强、稳定性好的引物P3、P4;利用此引物PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226 bp,对PCR产物进行测序分析可知与已克隆的鸭mtDNA COⅢ基因同源性达到100%,证明了所筛选引物的准确性。通过对不同含量的DNA模板溶液进行PCR扩增的方法,对筛选出的特异性引物P3、P4进行灵敏度试验,结果分析表明灵敏度约为0.001%,证明该PCR方法具有特异性强、灵敏度高的特点,完全可作为鉴别不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分的方法。

复方七芍降压片对自发性高血压大鼠肾动脉重塑的影响

【目的】探讨复方七芍降压片(三七、白芍、三麻等组成)对自发性高血压大鼠(SHR)肾动脉重塑的干预作用及机制。【方法】将SHR随机分为模型对照组、厄贝沙坦片组、复方七芍降压片组,每组10只,另设10只WKY大鼠为正常对照组。厄贝沙坦片组给予厄贝沙坦片混悬液27 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,复方七芍降压片组给予复方七芍降压片混悬液496.8 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,正常对照组和模型对照组给予等体积蒸馏水10 m L·kg^(-1)灌胃。每天给药1次,连续给药6周。给药结束后,苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠肾动脉组织病理变化,并测量管壁厚度、中膜厚度及相同位置的管腔直径,计算中膜厚度/管腔直径比值;免疫组织化学法检测肾动脉中Ⅰ型胶原(COⅠ)、Ⅲ型胶原(COⅢ)蛋白表达情况。【结果】与正常对照组比较,模型对照组大鼠肾动脉管壁厚度、中膜厚度/管腔直径比值增高(P<0.01),肾动脉组织COⅠ、COⅢ表达水平均明显升高(P<0.01);与模型对照组比较,复方七芍降压片组和厄贝沙坦片组大鼠肾动脉管壁厚度、中膜厚度/管腔直径比值降低(P<0.05),肾动脉组织COⅠ、COⅢ表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),2个给药组间差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】复方七芍降压片可改善SHR肾动脉重塑,其机制与抑制平滑肌细胞增殖、迁移及COⅠ、COⅢ胶原蛋白沉积有关。

应用高分辨率熔解曲线方法鉴定三带喙库蚊(双翅目:蚊科)

本研究旨在建立高分辨率熔解曲线准确、快速、特异鉴定三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus的方法。设计三带喙库蚊线粒体基因组COⅢ基因的特异性引物,在普通PCR基础上,进行高分辨率熔解曲线及其重复性分析。结果显示,普通PCR扩增出262 bp的COⅢ基因片段,经基因测序和序列分析,与形态学鉴定结果一致;三带喙库蚊有明显的高分辨率熔解曲线,对照蚊种和阴性对照均无熔解曲线;COⅢ基因熔解曲线走势差异较小,具良好的重复性。结果表明,基于COⅢ基因的高分辨率熔解曲线能准确、快速、特异的鉴定三带喙库蚊,可作为三带喙库蚊相关标本特异性鉴定的手段。

巨魾细胞色素氧化酶基因多态性及系统进化研究

采用PCR技术克隆得到12尾巨魾(Bagarius yarrelli)的细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)、细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)和细胞色素氧化酶Ⅲ(COⅢ)的基因序列。结果显示:巨魾COⅠ基因序列全长1 551 bp,12个个体共出现9个单倍型,13个突变位点;COⅡ基因序列全长691 bp,12个个体共出现5个单倍型,5个突变位点;COⅢ基因序列全长784 bp,12个个体出现7个单倍型,8个突变位点。通过最小进化法Minimum Evolution(ME)构建系统发育树分析显示,巨魾与14种鮡科鱼在序列上有一定的同源性,并且COⅠ、COⅡ和COⅢ都与中华纹胸鮡(Glyptothorax sinense)、福建纹胸鮡(Glyptothorax fukiensis)、三线纹胸鮡(Glyptothorax trilineatus)和长丝黑鮡(Gagata dolichonema)在同一个分支,表明巨魾与纹胸鮡属和黑鮡属有较近的亲缘关系。