嗜血杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立及在树鼩检测中的应用

目的建立树鼩中嗜血杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为树鼩微生物质量控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对NCBI中6株嗜血杆菌的外膜蛋白序列设计简并引物。通过4株嗜血杆菌标准菌株和24株它属菌株进行特异性和敏感性评价,将建立CODEHOP PCR检测方法,应用于树鼩嗜血杆菌的检测。结果简并引物HF1/HR8和HF3/HR3扩增标准菌株副鸡嗜血杆菌(ATCC 29545)、溶血嗜血杆菌(ATCC 33390)、流感嗜血杆菌(ATCC33391)、副流感嗜血杆菌(ATCC 33392)的目的片段分别为506bp^535bp和344bp^390bp,经测序和NCBI Blast比对,结果准确。两对引物组合,能够有效的区分嗜血杆菌属菌株与它属菌株,检测限最低可达2.1pg/μL。在受试的野生树鼩呼吸道样本中嗜血杆菌阳性率为33.3%(20/60)。结论所建立的方法具有较好的特异性和敏感性,操作简便,能够用于动物样品的嗜血杆菌检测。

巴斯德杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立巴斯德杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为实验动物的呼吸道细菌的控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对Genbank中13株巴斯德杆菌的RNA聚合酶β亚基(rpo B)氨基酸序列设计简并引物。对建立CODEHOP PCR方法用21株参考菌株进行特异性和敏感性评价,并应用于实验动物中的巴斯德杆菌检测。结果简并引物Past F6/PastR5扩增标准菌株的目的片段为200 bp左右。能够区分受试的巴斯德杆菌和主要的实验动物呼吸道病原菌。敏感性为0.2 pg/μL^2 pg/μL。在受试的609只实验动物中呼吸道样品中检测出巴斯德杆菌阳性率为19.1%。样品阳性片段经测序验证,准确率为100%。结论所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,可用于动物样品中巴斯德杆菌的检测。

CODEHOP RT-PCR方法在汉坦病毒基因型别鉴定和分子溯源中的应用

目的分析CODEHOP RT-PCR方法对于汉坦病毒(HV)基因型别鉴定和分子溯源中的应用效果。方法选取实验室保存的汉滩型病毒阳性鼠肺样品DX0901和汉城型病毒阳性鼠肺样品DX1101,用CODEHOP RT-PCR扩增HV病毒L基因片段并测序,进行Blast同源性比对和系统发生分析。结果两份样品均获得478bp大小的RT-PCR扩增产物,汉滩病毒DX0901与汉滩病毒株Nc167同源性最为接近,遗传距离为0.142。汉城病毒DX1101与汉城病毒株ZT10,ZT71,Z37同源性最为接近,遗传距离为0.049。结论 CODEHOP RT-PCR方法可以有效的用于对汉坦病毒进行基因型别鉴定和分子溯源。

应用CODEHOP PCR快速检测水体中致病性弧菌

目的建立可以快速检测不同致病性弧菌的CODEHOP PCR方法。方法以致病性弧菌共有的DNA旋转酶B亚单位氨基酸为目标,采用CODEHOP程序,设计一对引物,建立弧菌CODEHOP PCR检测方法,以8种不同致病性弧菌菌株及其他菌株为模板,评价方法的灵敏度、特异性,并对64份入境船舶压舱水进行致病弧菌检测。结果该方法特异性好,8种致病性弧菌标准菌株均获得特异性扩增条带,检测灵敏度可以达到3×103CFU/ml,从64份入境压舱水中检测到14份阳性样品,PCR产物经TA克隆后,测序分析确定为4种不同致病性弧菌。结论本研究所建立的方法可用于致病性弧菌的快速检测与种类鉴定。

利用简并PCR克隆烟草节杆菌02181肌酸酶基因

目的用简并PCR从烟草节杆菌02181中扩增出肌酸酶部分序列,以期获得其全长编码基因。方法从NCBI查询已发表的肌酸酶蛋白质序列,将其递交到Block Maker服务器,利用工具软件CODEHOP设计简并引物,以烟草节杆菌02181基因组DNA为模板做PCR。结果将所得目的片段(414bp)在NCBI上BLASTx,结果表明,所得序列与不同菌种来源的肌酸酶高度同源,其中与节杆菌属肌酸酶基因的同源性最高,一致性达到了71%。结论从烟草节杆菌02181中成功克隆出了肌酸酶基因的部分序列。

简并PCR法克隆L.starkeyi苹果酸酶基因

根据已报道的酵母苹果酸酶基因序列,利用CodeHop(Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)软件设计两对简并引物,以斯达油脂酵母(L.starkeyi CICC 1809)总DNA为模板做简并PCR,得到2个基因片段(ME1,ME2).对这2个目的片段进行测序,将结果翻译成氨基酸序列,blastp结果显示其中ME2片段为油脂酵母未报道苹果酸酶基因的序列(Gene Bank登录号GU348991),并对巢式PCR方法检验简并PCR结果的有效性进行了评估.

鼠类感染沙粒病毒CODEHOP RT-PCR检测方法的建立

目的建立鼠类感染沙粒病毒的CODEHOPRT—PCR检测方法。方法依据沙粒病毒N蛋白氨基酸序列设计1对CODEHOP引物，建立沙粒病毒一步RT—PCR检测方法，分析该引物在对不同种沙粒病毒基因序列上的结合位点及所能获得的产物序列大小；通过检测分离自鼠类的沙粒病毒属淋巴细胞脑膜炎病毒（LCMV）株MS111013，评价方法的特异性和灵敏度；对MS111013扩增产物进行Blast同源性比对。结果从GenBank获得的22种沙粒病毒均存在CODEHOP引物结合位点，扩增产物大小在406～429bp之间。建立的CODEHOPRT—PCR方法可特异性扩增LCMV病毒核酸，目的片段大小与预期结果相符，核酸的最小检出量为11．8Pg。经Blast比对，MS111013与LCMV病毒株Douglas strain（4707）同源性较高，为86％。结论建立的沙粒病毒CODEHOPRT—PCR检测方法敏感、特异，可用于鼠类沙粒病毒感染检测。

CODEHOP RT-PCR技术在黄病毒属病毒筛查中应用

为了探讨CODEHOP RT-PCR技术在黄病毒属病毒筛查中的应用效果,根据GenBank发表的不同黄病毒多聚蛋白氨基酸序列,利用CODEHOP方法设计合成一对简并引物,用一步RT-PCR对乙型脑炎病毒株JEV1201、登革热病毒株JKD001和黄热疫苗YV6161进行检测,扩增产物测序后进行BLAST同源性比对和系统分生分析。结果显示该方法可以特异的对黄病毒进行扩增,目的片段的大小和序列与预期结果相符,JEV1201与乙脑病毒株YL2009-4/YC2009-3同源性最为接近,位于乙脑病毒株进化树分支。JKD001与登革热病毒株DENV-2/ID/1022DN/1975同源性最为接近,位于登革热病毒株进化树分支。YV6161与黄热病病毒株17D同源性最为接近,位于黄热病病毒株进化树分支。由此可知CODEHOP RT-PCR技术可以被有效的用于对黄病毒属病毒的筛查、种类鉴定和分子溯源。

汉坦病毒群CODEHOP RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种能对汉坦病毒群进行快速检测的CODEHOP引物RT-PCR方法。方法根据GenBank发表的不同汉坦病毒L基因组氨基酸序列,利用CODEHOP方法设计合成一对引物,经反应条件优化,建立快速检测汉坦病毒群所有病毒的方法,并通过对标准毒株的检测评价方法的灵敏度和特异性。结果特异性试验结果显示,该方法可对汉坦病毒进行特异性扩增,目的片段大小和序列与预期结果相符,对汉坦病毒核酸的最小检出量为10pg。结论建立的CODEHOP RT-PCR方法的特异性强、灵敏度高,可用于汉坦病毒群的检测。

黄病毒属病毒CODEHOP RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种能快速检测黄病毒属病毒的CODEHOPRT—PCR方法。方法根据GenBank发丧的不同黄病毒多聚蛋白氯基酸序列，利用CODEHOP方法设计合成一对引物，建立能快速检测黄病毒属所有病毒的CODE～HOPRT—PCR方法，并用3种不同病毒株对该方法进行特异性和灵敏度评价。结果建立的CODEHOPRTPCR能埘黄病毒RNA进行特导性扩增，目的片段的大小（400-500bp）和序列与预期结果相符。该方法对黄病毒恢酸的最小检出量为8Pg。结论建立的CODEHOPRT—PCR方法特异强、灵敏高，可用于黄病毒的榆测。

程序化设计简并引物与克隆小菜蛾酯酶基因

利用遗传密码简并性 ,针对特定的氨基酸序列设计简并引物 ,是克隆蛋白质家族cDNA的常规方法。文章介绍了利用blastp ,blockmaker,CodeHop ,SwissProt,SpTrEMBL等网络工具及数据库设计昆虫抗性酯酶的简并引物。用这对引物从抗有机磷杀虫剂的小菜蛾Plutellaxylostella中克隆了 1段cDNA。经blastx检索genebank,发现此cDNA产物与其它昆虫抗性酯酶基因有高度的相似性。研究表明 ,程序化设计的简并引物可信性强 ,阳性率高 。

蚊类携带甲病毒属病毒CODEHOP RT-PCR检测方法的建立

目的建立蚊类感染甲病毒属病毒的CODEHOPRT—PCR检测方法。方法依据甲病毒属病毒非结构蛋白氨基酸序列，设计1对CODEHOP引物，建立甲病毒属病毒一步RT—PCR检测方法，分析该引物在对不同种甲病毒基因序列上的结合位点及所能获得的产物序列大小；通过检测甲病毒属基孔肯亚病毒JC2012株，评价该方法的特异性和灵敏度：对JC2012扩增产物进行Blast同源性比对。结果建立的CODEHOPRT-PCR方法可特异性扩增基孔肯亚病毒核酸，目的片段的大小与预期结果相符，核酸的最小检出量为56．7pg。经Blast比对，结果与Genebank公布的CHIKVJC2012序列结果一致。同时从GenBank获得的22种甲病毒均存在CODEHOP引物结合位点．扩增产物大小在510～550bp之间。结论建立的甲病毒CODEHOPRT—PCR检测方法敏感、特异，可用于蚊类甲病毒感染检测。