表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定

用疑似患猪流行性腹泻病(PED)的病猪肠病料,根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S糖蛋白基因设计引物进行RT-PCR扩增,获得531 bp的PEDV部分保护性抗原基因,将其克隆入pMD18-T载体后测序,核苷酸序列与PEDV CV777株相应序列的同源性为99.4%。根据测序结果和表达载体特点,设计一对引物,扩增PEDV部分保护性抗原基因(COE基因)501 bp片段。将COE基因与乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149进行连接,电击转化入食品级乳酸乳球菌NZ3900细胞。重组菌以1 ng/mL乳链菌肽(Nisin)诱导,通过SDS-PAGE和Western blot分析,PEDV部分S蛋白成功表达,并具有反应原性。间接免疫荧光试验表明,重组菌表达蛋白定位于菌体细胞表面。

猪流行性腹泻病毒COE基因在毕赤酵母中的表达及生物活性分析

旨在利用毕赤酵母表达系统表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)COE蛋白,及研究COE蛋白免疫小鼠后产生抗体的中和病毒的能力。根据PEDV S糖蛋白基因设计引物,取患猪流行性腹泻病(PED)的仔猪肠道组织,抽提PEDV的总mRNA,进行RT-PCR扩增,获得PEDV部分保护性抗原基因(COE基因)片段。进一步将COE基因导入毕赤酵母表达载体,构建毕赤酵母表达质粒pPIC9K—COE重组质粒,并电转化入酵母感受态细胞GS1 15中,筛选高拷贝阳性重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白及其免疫原性,病毒中和试验评价重组蛋白免疫小鼠后血清抗体的病毒中和能力。RT-PCR扩增获得大小为530 bp的PEDV COE基因,该基因在毕赤酵母表达载体中能够正确表达,SDS—PAGE结果显示毕赤酵母表达的COE蛋白大小在27 ku左右,分泌表达量约30 mg·L^(-1)。Western blot表明PEDV COE重组蛋白具有反应原性。中和试验结果表明,PEDV COE重组蛋白免疫小鼠后血清中特异性抗体具有中和活性,中和效价为1:36,而对照则小于1:2。PEDV COE基因可在毕赤酵母中获得分泌表达,且表达的蛋白具有很好的生物学活性。

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达和免疫原性分析

为研究猪流行性腹泻病毒中COE基因的原核表达情况及免疫原性,从感染猪流行性腹泻病毒的猪体内采集肠内容物、肠段及肠系膜淋巴结,参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株的COE基因序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增出COE基因,克隆到原核表达载体pET-32α上,并构建重组表达质粒pET-32α-COE,在大肠杆菌Rosetta中进行表达,并进行Western blot检测。结果显示,重组蛋白获得了高效的表达,并能与多抗血清发生特异的免疫印迹反应。COE基因是猪流行性腹泻病毒的中和抗原位点,具有良好的免疫学活性。

猪流行性腹泻病毒COE蛋白的原核表达及免疫原性分析

为表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中和抗原表位COE蛋白,分析其免疫原性,为PEDV的检测和亚单位疫苗的开发奠定基础。参考GenBank中PEDV COE基因序列,人工合成并经生物信息学综合分析后,将合成的基因片段插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a-COE,将鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希氏菌TransB(DE3)中,用IPTG诱导目的蛋白表达,并进行SDS-PAGE鉴定;然后用纯化的目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化,免疫猪后用ELISA方法检测猪血清中PEDV特异性抗体水平。结果表明,目的蛋白在大肠埃希氏菌TransB(DE3)中获得表达,用His标签纯化得到了与预期大小35 ku相符的COE融合蛋白,经复性、浓缩后的蛋白浓度为1.85 mg/mL。用该蛋白作为亚单位疫苗免疫猪,ELISA方法检测免疫猪产生了高滴度的血清PEDV特异性抗体。表明原核表达的COE蛋白具有良好的免疫原性,可作为候选的亚单位疫苗。

猪流行性腹泻病毒荧光抗体的制备及应用

本研究旨在建立一种可辅助猪流行性腹泻病毒(PEDV)分离鉴定的直接荧光抗体检测方法。借助基因工程技术融合表达PEDVS1基因中和抗原表位区域(COE),层析柱法纯化兔源免疫球蛋白IgG,搅拌法标记荧光素。通过Western blotting和动物免疫试验测定表达融合蛋白的抗原性,间接ELISA方法测定免疫后的抗体效价,直接免疫荧光法测定标记荧光抗体的特异性,梯度稀释方法测定标记抗体的最佳工作浓度。结果显示,本研究成功将423bp的S1基因中和抗原表位COE进行融合表达,表达蛋白大小约40ku,蛋白命名为pGEX-6P/COE;Western blotting检测结果表明,融合蛋白具有良好的反应原性;ELISA检测结果显示,免疫后35d的血清抗体效价达1∶25 600;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪瘟病毒(CSFV)及猪细小病毒(PPV)等均无非特异性反应,标记的荧光抗体具有良好的特异性,最佳工作稀释度为1∶32~1∶64。综上所述,本试验制备的直接免疫荧光抗体可用于细胞平台上的PEDV快速检测,能直观地提供相关检测数据,对于病毒分离过程的取舍具有重要指导意义。

表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原重组乳酸杆菌的构建及鉴定

为开发一种安全有效的新型猪流行性腹泻口服疫苗,将猪流行性腹泻病毒核心保护性抗原基因(COE)插入到穿梭表达载体,并电转化至乳酸杆菌基因工程菌株内,进行诱导培养,通过Western blot能够检测到大小约27 KD的蛋白表达。该重组乳酸杆菌的构建为动物体内免疫试验的开展和新型黏膜免疫疫苗的研发奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒贵州株部分S基因原核表达质粒的构建

为给贵州猪流行性腹泻(PED)的诊断及防治提供科学依据,同时为猪流行性腹泻病毒(PEDV)部分S蛋白进一步表达建立相应检测方法奠定理论基础,利用贵州PEDV分离株,参考GenBank登录PEDV CV777株的S基因序列,选取主要抗原区域(COE)设计1对PEDV COE基因特异性引物,进行部分保护性抗原COE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD19-T载体链接,鉴定正确后再亚克隆至pET32a位置,结果成功构建了贵州PEDV分离株COE基因的原核表达质粒,分离株COE基因与HBQX株的序列同源性达99.1%,与经典毒株CV777株的同源性为93.4%。

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达及其表达产物的生物活性分析

为了获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)COE基因在原核表达载体pET-32a(+)中的表达产物,并检测表达产物的生物活性,根据猪流行性腹泻病毒COE基因的全序列设计引物,以pCMV-PEDVCOE质粒作为模板,通过PCR扩增得到COE基因编码区的序列,将其克隆至含有6×His tag的原核表达载体pET-32a(+)中进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化,以此纯化产物为包被抗原建立了ELISA检测方法,并用该方法对39份感染PEDV猪血清进行了检测。结果显示,COE基因在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,获得与预期分子质量相符的融合蛋白条带。经Western-blot检测,该蛋白能与Anti-PEDV单克隆抗体发生特异性反应。该融合蛋白纯化、复性后的质量浓度为0.7mg/mL。采用以融合COE蛋白为包被抗原建立的ELISA对39份PEDV感染猪血清的检测结果都为阳性,说明该融合蛋白具备作为包被抗原建立ELISA抗体检测方法的潜力。

靶向肠道M细胞的PEDV COE基因的蛋白表达与纯化

为构建靶向肠道微折叠细胞(microfold cell, M细胞)的猪病毒性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)COE基因的原核表达载体并表达重组蛋白,用于后续将PEDV抗原靶向M细胞引发黏膜免疫应答来制备亚单位疫苗奠定基础。将M细胞靶向肽Col基因插入至PEDV COE基因的C端,设计引物扩增COE和COE-Col基因序列,并构建原核表达载体pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col。将其转化到大肠杆菌TransB(DE3)中进行IPTG诱导和SDS-PAGE验证蛋白表达后,使用HisTrapFF Crude亲和层析柱纯化并浓缩。结果表明,成功克隆了PEDV COE和插入靶向肽Col的COE-Col基因并分别构建了原核表达载体,转化TransB(DE3)诱导后表达成功,纯化后在约35 kDa(COE)和37 kDa(COE-Col)均得到单一的蛋白条带,复性浓缩后质量浓度提高,为后续利用M细胞激发的黏膜免疫治疗PEDV及其他疾病提供方向和奠定理论基础。

猪流行性腹泻病毒COE蛋白原核表达及其反应原性的初步鉴定

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)的优势抗原表位COE可溶性原核表达及其反应原性,试验采用RT-PCR方法扩增出COE基因,将其克隆至原核表达载体p MAL-C5X上,构建重组质粒p MAL-C5X-COE,经测序鉴定正确后转化Rosetta感受态细胞,并进行IPTG诱导表达和Westernblot验证。结果表明:重组菌p MAL-C5X-COE表达的融合蛋白MBP-COE的分子质量约为57 ku,优化的诱导条件为IPTG浓度0.8 mmol/L、诱导时间4 h,诱导温度30℃,重组蛋白以可溶性蛋白形式存在于菌体中,融合蛋白与兔抗PEDV多克隆抗血清发生特异的免疫印迹反应。说明原核表达的COE融合蛋白可溶且具有良好的反应原性。

2016—2019年山东省仔猪腹泻病原调查及PEDV分离株S基因遗传进化分析

本研究于2016年6月至2019年3月从山东省部分地区收集了231例疑似猪流行性腹泻(PED)病猪样品,患病仔猪主要临床症状为发热、呕吐、水样腹泻、体质量减轻和脱水,并有较高的病死率。通过PCR/RT-PCR对样品进行相关腹泻病原检测。检测结果显示,猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性病料147份,阳性率为63.63%;猪圆环病毒2型(PCV2)检出率为16.88%(39/231);猪轮状病毒(PoRV)检出率为5.19%(12/231),猪传染性胃肠炎(TGEV)检出率为0.43%(1/231)。本研究分离到7株PEDV,对其S基因序列进行遗传进化分析,结果显示,分离株与PEDV参考株的核苷酸序列同源性为93.1%~98.9%,氨基酸序列同源性为91.5%~98.7%。分离株与疫苗株CV777有不同程度的核苷酸和氨基酸位点突变,部分突变氨基酸位点位于PEDV抗原表位区域(COE)和抗原表位S1D5、S1D6中。本研究结果表明vPEDV在山东省广泛流行,是引起仔猪腹泻的主要病原因素,研制新型PEDV疫苗已迫在眉睫。