基于cox Ⅰ基因对猪囊尾蚴河南分离株种系发育关系的研究

利用RT-PCR技术从河南部分地域的猪囊尾蚴中获得10个分离株的cox Ι部分基因序列,其长度为344bp;将其克隆入pMD19-T并测序;分别用Clustal X 1.81程序对序列进行比对,然后用PAUP 4.0程序MP法和NJ法绘制种系发育树,并用PUZZLE 5.2程序构建最大似然树;同时利用WDANSIST 2.5程序和DNAstar 5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果表明,10个河南猪囊尾蚴分离株的coxΙ部分基因序列完全一致,属于猪带绦虫亚洲基因型;猪囊尾蚴coxΙ部分基因可有效区分出Asian和American/African两种基因型,并可用于不同种带科绦虫的鉴别诊断。因此,猪囊尾蚴coxΙ基因有望作为一种鉴别基因用于带科绦虫病和囊尾蚴病的PCR鉴别诊断。

COX Ⅰ和COX Ⅲ在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

目的：统计结直肠癌中COXⅠ和COX Ⅲ的表达情况，分析COXⅠ和COX Ⅲ表达意义。方法随机选取2009年3月份～2013年12月份我院外科手术治疗的60例结直肠癌病患者为实验对象，术中留取结直肠癌组织60例，正常结直肠粘膜58例，应用免疫组化法对两种组织中COXⅠ和COX Ⅲ的表达情况进行检测分析。结果正常结直肠黏膜中 COXⅠ和COXⅢ阳性表达率（73.33%和68.33%）显著高于结直肠癌组织（29.31和24.48%）。结论 COXⅠ和COX Ⅲ在结直肠癌组织呈低表达，其有望成为评估预后的早期预测指标。

大熊猫等8种野生哺乳动物蛔虫的线粒体COXⅠ和COXⅡ基因的亲缘关系分析

为了探讨寄生于大熊猫、小熊猫、北极熊、棕熊东北亚种、棕熊西藏亚种、黑熊四川亚种、黑猩猩和白眉长臂猿体内蛔虫的分类地位,采用PCR技术扩增了这些野生动物体内寄生蛔虫的线粒体COXⅠ、COXⅡ基因序列,并与GenBank中注册的同源性序列进行了分析。序列分析结果显示:扩增的8种野生哺乳动物蛔虫的COXⅠ、COXⅡ基因长度均分别为393和582bp,其中大熊猫与小熊猫及4种熊科动物蛔虫COXⅠ和COXⅡ基因的相似性分别为94.8%～95.0%和94.9%～95.5%;黑猩猩和白眉长臂猿蛔虫的COXⅠ、COXⅡ基因的相似性分别为99.8%和99.5%。分子系统树(NJ/MP/ML)表明,寄生在大熊猫、小熊猫和4种熊科动物体内的蛔虫均为贝蛔属(Baylisascaris)蛔虫;而黑猩猩和白眉长臂猿体内寄生的蛔虫应为蛔属(Ascaris)蛔虫。同时,分析结果也揭示了蛔虫与宿主之间存在协同进化关系。

青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)基因的克隆鉴定及表达分析

细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)是线粒体内呼吸链电子传递的终末复合物,是线粒体氧化能力的关键调节物质。细胞色素C氧化酶亚基I(COXⅠ)是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3个亚基之一。本研究以本实验室构建的青石斑鱼消减杂交cDNA文库中长587bp的EST序列为基础,采用RACE-PCR方法克隆鉴定出青石斑鱼(Epinephelus awoara)细胞色素C氧化酶亚基I基因。研究结果表明:青石斑鱼COXⅠ全长1659bp,5'端非编码区3bp,3'端非编码区105bp,开放阅读框1551bp,编码516个氨基酸。序列分析表明,青石斑鱼COXⅠ与线纹刺尾鲷COXⅠ同源性最高,达96.9%。采用半定量RT-PCR方法研究COXⅠ基因在青石斑鱼各组织中的表达特征,结果表明COXⅠ基因在正常的青石斑鱼和注射了副溶血弧菌灭活疫苗的青石斑鱼的脾、肝、心、头肾、肾、肌肉和鳃中都有转录表达。注射副溶血弧菌灭活疫苗后,除了鳃组织,其他组织中COXⅠ基因表达量较对照组都有显著提高(P<0.05),而鳃组织中的COXⅠ基因表达量没有显著变化。

幽门螺杆菌对食管癌COXⅠ表达的影响

目的观察幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)作用于食管癌细胞后细胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidaseⅠ,COXⅠ)mRNA及其蛋白表达的变化,探讨Hp在肿瘤发生发展中可能的作用机制。方法将Hp与食管癌细胞分别作用4、8、24 h,收集细胞,应用Real-Time PCR和Western blot法检测各时间点COXⅠmRNA及其蛋白表达。结果 Hp与食管癌细胞共培养4、8、24 h后,COXⅠmRNA表达量逐渐减少,4 h的表达量显著低于对照组,其后下降速度减慢,24 h后表达量不再有明显改变。COXⅠ蛋白表达呈现相似的趋势。结论 Hp与食管癌细胞共培养后,可导致线粒体编码基因COXⅠmRNA及其蛋白表达障碍,从而影响线粒体功能。

基于COXⅠ及ITS基因粪类圆线虫PCR鉴定方法的建立

目的探讨以COXⅠ及ITS基因作为分子标记的PCR技术在粪类圆线虫病诊断中的应用。方法收集粪类圆线虫病患者的粪便作为检验物,离心沉淀法处理粪便,弃去粪渣,浓集、纯化粪便中的粪类圆线虫虫体,光学显微镜下观察虫体做形态学初判。PCR扩增COXⅠ及ITS基因,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段。结果琼脂糖凝胶电泳紫外成像显示,COXⅠ和ITS基因目的条带单一、清晰,大小分别约为1500bp和900bp。COXⅠ基因的退火温度为48℃、ITS退火温度为50℃时有清晰的特异性条带。COX I基因条带与Genebank中其他线虫COX I基因片段大小一致,可作为粪类圆线虫虫种鉴定的分子标记。而在Genebank中检索到不同线虫的ITS基因,分别含有18S、5.8S和28S的部分或完全序列,因此碱基长度变化较大,若以ITS鉴别虫种需进一步做Blast分析。结论基于COXⅠ及ITS基因的粪类圆线虫分子检验方法应用于临床上,可有效提高粪类圆线虫病诊断的特异性和敏感性。

香螺线粒体COXⅠ和CYTB基因遗传多样性研究

为探明香螺Neptunea cumingii遗传多样性水平及其种质资源背景,采用分子生物学技术对中国黄、渤海海域6个不同地理群体香螺COXⅠ和CYTB基因的遗传多样性进行比较分析。结果表明:COXⅠ基因序列长度为1536 bp,多态性位点141个,共定义COXⅠ单倍型11个,大连市大连湾群体(DL)的单倍型COXⅠ-10变异位点数最多(115个),群体内遗传多样性分析显示,大连湾群体的平均核苷酸差异数(K)和遗传多样性指数(P i)最高,分别为31.133和0.02121,群体间比较结果显示,烟台市八角港群体(YT)与蓬莱市长岛群体(PL)间的K值最低(2.094),大连湾群体与大连市旅顺盐场群体(LS)间的K值最高(24.971);CYTB基因序列全长为1140 bp,多态性位点34个,共定义单倍型14种,群体内遗传多样性分析显示,大连市獐子岛群体(ZZ)和大连市旅顺盐场群体的K和P i值最高,分别为13.444和0.01236,群体间比较结果显示,烟台市八角港群体与蓬莱市长岛群体间K值最低(1.395),大连湾群体与旅顺盐场群体间的K值最高(11.497);聚类分析结果显示,6个不同群体香螺的线粒体COXⅠ和CYTB基因有显著性差异,分子方差分析(AMOVA)显示,群体内变异远大于群体间差异。研究表明,不同海域香螺未出现明显的群体间差异,且群体内变异远大于群体间差异,不同海域间香螺未达到亚种分化。

基于线粒体COX Ⅰ基因犬复孔绦虫的分子鉴定及功能分析

目的探讨从犬复孔绦虫的固定标本和新鲜虫体中扩增保守序列线粒体COXⅠ鉴定虫种并分析功能。方法从犬小肠内获取犬复孔绦虫成虫节片提取DNA,PCR扩增线粒体COXⅠ,进行电泳鉴定并测序;用BLAST比对序列、构建进化树并预测生物信息学功能。结果固定标本和新鲜标本中DNA扩增产物电泳后均显示特异性明显的条带,测序显示COXⅠ基因总长为415 bp,其编码的蛋白为疏水性蛋白,具有3个典型的跨膜螺旋,7个B细胞抗原表位。结论虫体经70%乙醇固定处理后,不影响犬复孔绦虫的基因组提取和COXⅠ序列扩增,且线粒体COXⅠ适合作为犬复孔绦虫虫种鉴别的分子标记。

捻转血矛线虫线粒体COXⅠ基因序列测定及进化分析

为了对捻转血矛线虫进行分子鉴定,并且探寻其与毛圆科内不同属线虫存在差异的分子水平关联性,对采自牦牛体内的捻转血矛线虫线粒体COXⅠ基因部分序列进行扩增与进化分析,扩增出的序列登录到GenBank,登录号：KU314701。进化分析结果显示,捻转血矛线虫H-yak线粒体COXⅠ基因与毛圆科不同属线虫的线粒体COXⅠ基因同源性在85.5%～97.4%之间,其中与KJ724363.1的同源性最高,达到97.4%;其编码的蛋白氨基酸序列与血矛属线虫的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ蛋白的氨基酸序列完全相同,同源性为100%,且与长刺属线虫的同源性极高,同为100%,但与古柏属和奥斯特属的线虫蛋白同源性均为98.7%。该研究在基因和蛋白两个层面间接印证了毛圆科内不同属线虫在形态和生活史方面有较多相似和不同之处。

中国近海铜藻ITS与coxⅠ序列相似性分析

本研究分别对2016和2017年中国近海10个铜藻(Sargassumhorneri)漂浮地理种群以及3个定生种群的51个采集样本进行了ITS和coxⅠ序列分析及相似性比对。结果显示,51个样本的coxⅠ序列完全一致,ITS序列存在2个变异位点,按基因型的异同可分为4个类型,其中大连龙王塘、烟台大钦岛和南隍城岛的漂浮铜藻基因型相同,青岛金沙滩漂浮型、烟台大钦岛和大连獐子岛的定生铜藻基因型相同,威海俚岛和温州洞头的漂浮铜藻基因型相同,青岛雕塑园、王哥庄、大珠山、威海乳山的漂浮型和枸杞岛定生铜藻基因型相同,而同一种群内部即便是不同年份的个体间基因型并没有差异。基于ITS序列构建的系统树显示,来自中国的所有铜藻样本聚为一支,与来自韩国的铜藻样本有一定的遗传距离。以上结果说明,我国近海漂浮和定生铜藻的不同地理株间ITS和coxⅠ的遗传变异水平较低,漂浮铜藻可能具有不同的来源,为进一步探明中国近海海域铜藻的分子遗传背景提供依据。

大熊猫细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因的克隆及生物信息学分析

细胞色素氧化酶(COX)作为一种线粒体呼吸链中的限速酶,在物种进化和能量代谢的研究中具有重要价值。本研究利用基因克隆技术及生物信息学方法开展了COX Ⅰ的核苷酸序列和氨基酸序列比对,系统发育分析,亲、疏水性分析及蛋白质结构预测等。结果显示:大熊猫COX Ⅰ基因编码的蛋白由514个氨基酸组成,等电点为6.22,分子质量为56.9 ku;COX Ⅰ蛋白是疏水性蛋白质,氨基酸含量最高的是亮氨酸;二级结构预测结果显示COX Ⅰ蛋白以无规则卷曲为主。本研究结果为进一步开展大熊猫进化及COX Ⅰ的功能研究提供了参考。

幽门螺杆菌对胃癌细胞线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ表达的影响

目的观察幽门螺杆菌(H.pylori)作用于胃癌细胞后线粒体编码基因COXⅠmRNA及蛋白的表达变化,探讨H.pylori致胃癌的分子机制。方法H.pylori培养滤液分别作用于胃癌细胞4、8和12 h后,收集细胞,应用RT-PCR和W estern b lot法检测各时相点COXⅠ基因和蛋白表达变化。结果H.pylori培养滤液作用4 h后,线粒体COXⅠmRNA的表达开始降低,8 h下降更明显,12 h下降速度减缓。各时相点的表达量明显低于对照组(P<0.05)。COXⅠ蛋白表达呈现出相同的趋势,各时相点的表达量明显低于对照组(P<0.05)。结论H.pylori可下调胃癌细胞线粒体编码基因COXⅠmRNA及蛋白的表达,影响线粒体功能。

基于COX I基因的太平洋西岸文昌鱼地理种群分析

文昌鱼是进化发育研究的重要模式动物,目前实验材料均采自野外。因此,对其进行正确的物种鉴定和地理种群的遗传分化分析十分必要。该研究扩增并测定了COXⅠ基因部分序列,结合NCBI数据库中的COXΙ序列信息,对太平洋西岸文昌鱼的种类和地理种群分化情况进行了分析。结果表明,马来文昌鱼(Branchiostoma malayanum)、白氏文昌鱼(B.belcheri)和日本文昌鱼(B.japonicum)这3个种之间的遗传差异很大,再次证实3个物种的有效性,同时提出应当审慎对待NCBI数据库中文昌鱼的种名标注;太平洋西岸文昌鱼属Branchiostoma的3种文昌鱼群体遗传多样性均处于较高水平,同一物种的不同地理种群间没有出现明显的遗传分化,反映了海洋动物的基因交流较容易,不同海域隔离较弱。

黑熊蛔虫线粒体cox1基因序列进化分析研究

本研究主要针对采自长沙生态动物园和长沙市天心区希有动物驯养中心的4个黑熊蛔虫样本进行线粒体DNA中细胞色素Ⅰ(cox1)基因序列通过PCR方法扩增,利用DNA分析软件DNASTar 5.0将测得的序列分别与GenBank中登录的蛔虫序列和本地其他野生动物蛔虫序列,进行比较分析。结果显示:来自长沙生态动物园和长沙市天心区希有动物驯养中心的蛔虫cox1基本一致,长度约为400~414 bp;与采自荷兰株登录号KC543477.1贝氏蛔虫同源性最高达96.3~97.5%;4个黑熊蛔虫样本与KC543477.1贝氏蛔虫在同一分枝上。结果表明:采自长沙生态动物和长沙市天心区希有动物驯养中心黑熊蛔虫与熊贝氏蛔虫同源性最大,为熊贝氏蛔虫;pcox1序列在本研究中表现种间差异大,种内相对保守,说明cox1基因可以作为熊贝氏蛔虫和狮弓蛔虫的分子分类学及种群遗传关系研究的分子遗传标记。

建立一种快速鉴定大西洋鳕鱼及其制品的SYBR Green荧光PCR方法

通过大西洋鳕鱼CoxI序列的比对分析,在序列的差异处设计了大西洋鳕鱼的特异性引物,建立了一种大西洋鳕鱼SYBR Green荧光PCR定性检测方法,并进行了引物特异性和灵敏度分析.结果表明:检测的大西洋鳕鱼样品和49份其他动、植物样品DNA中,只有大西洋鳕鱼样本出现显著扩增,6次平行反应的Ct值为23.216±0.113,5份大西洋鳕鱼同属鳕鱼样品和44种常见其他动、植样品均无明显扩增曲线.模拟样品灵敏度检测实验显示,该特异性引物可用于检测质量分数为0.01%的大西洋鳕鱼肉粉,灵敏度可达0.06ng/μL.通过对市售鳕鱼片检测的验证,该方法特异性强,灵敏度高,可用于食品中大西洋鳕鱼成分真实性的鉴别.

应用COXⅠ基因PCR-RFLP对我国旋毛虫地理株的鉴定

目的对我国旋毛虫不同地理株进行分子鉴定。方法根据旋毛虫线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(cytochromec-oxidase subunitⅠ,COXⅠ)基因序列合成1对引物,以旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)、乡土旋毛虫(T.nativa,T2)、布氏旋毛虫(T.britovi,T3)、伪旋毛虫(T.pseudospiralis,T4)、纳氏旋毛虫(T.nelsoni,T7)的国际参考株作为对照,应用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restrictionfragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术对我国7个猪源旋毛虫地理株(河南、湖北、云南、西安、哈尔滨、同江及天津株)进行分子鉴定。结果T1、T2、T3、T4、T7和我国7个猪源旋毛虫地理株的COXⅠ基因均扩增出419 bp的片段,PCR扩增产物Tru1Ⅰ(MseⅠ)酶切后经RFLP分析,T2、T3、T4、T7和天津株均具有独特的酶切带型:T2为22、70和327 bp,T3为92和327 bp,T4为419 bp,T7为62、64、70和223 bp,天津株为92、126和201 bp;其他6个地理株的酶切带型和T1一致,为22、70、126和201 bp。结论我国7个旋毛虫地理株的COXⅠ基因片段(92、70和22 bp)存在种内多态性;河南、湖北、云南、西安、哈尔滨及同江株可归为一类,天津株可归为另一类。

云南兰坪地区带绦虫mtCOXⅠ片段测定分析

目的对云南兰坪地区带绦虫种类进行鉴定。方法选取成虫样本,进行基因组抽提,扩增线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(mtCOXⅠ)部分基因片段,序列测定后,用生物学软件DNA MAN进行同源性分析并构建系统发育树。结果LP1和LP4同源性达99.8%,LP1-4与BZ2-3的同源性均在95%以上,而与BZ1的同源性较远,低于88%。亚洲带绦虫与牛带绦虫较接近,远离猪带绦虫。结论云南兰坪地区带绦虫株与亚洲带绦虫标准株相似,同属于亚洲带绦虫。mtCOXⅠ片段可用于带绦虫分类鉴定。

菲律宾蛤仔及其制品的Taqman荧光PCR鉴定方法

目的建立菲律宾蛤仔成分Taqman荧光PCR定性检测方法。方法根据菲律宾蛤仔线粒体细胞色素氧化酶CoxⅠ基因中的保守基因序列设计一对菲律宾蛤仔特异性引物,通过Taqman荧光PCR法进行PCR扩增反应,对菲律宾蛤仔成分进行特异性检测。结果该方法的引物对于菲律宾蛤仔成分的特异性良好;菲律宾蛤仔DNA检出限为0.04 ng/μL,可达菲律宾蛤仔肉粉质量分数的0.001%。通过对市售菲律宾蛤仔制品的检测,该方法可检测出制品中的菲律宾蛤仔成分。结论该检测方法特异性强,灵敏度高,能够用于食品中菲律宾蛤仔成分的真实性鉴别。

大通犊牦牛组织线粒体COX酶活性与亚基COX-Ⅰ、Ⅱ mRNA表达的相关性研究

为探讨"大通犊牦牛"组织线粒体COX活性与亚基COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量之间的关系。采用酶联免疫分析法(ELISA)对犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织线粒体COX活性进行测定;绝对定量荧光PCR(Real-time PCR)检测组织中COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量。结果显示:大通犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织线粒体COX活性高于乐都犊牦牛;大通犊牦牛组织间COX-Ⅰ基因拷贝数明显高于乐都犊牦牛(P<0.05);大通犊牦牛组织间COXⅡ拷贝数以及乐都犊牦牛COXⅡ拷贝数均差异显著(P<0.05),大通犊牦牛不同组织中的COX-Ⅰ、Ⅱ的表达量与乐都犊牦牛相比差异显著(P<0.05)。结果表明:含野血的大通犊牦牛组织线粒体COX的氧化磷酸化作用要强于家犊牦牛;线粒体COX两种亚基mRNA变化与组织和品种有关;COX活性变化可使COX-Ⅰ、ⅡmRNA发生失调。

基于coxⅠ、ITS和rbcL基因序列的马尾藻系统进化分析

本研究以海南省青葛港马尾藻属(Sargassum spp.)为研究对象,利用coxⅠ(细胞色素C氧化酶亚基I)、ITS(内转录间隔区)序列及rbcL(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基)3种DNA条形码分析马尾藻属遗传进化关系。结果表明,(1)基于形态鉴定及利用coxⅠ、ITS和rbcL三种DNA条形码进行分子鉴定的方式鉴定出9种海南省青葛港常见马尾藻属物种;(2)利用rbc L基因扩增出DNA序列的GC含量最低(32%),ITS基因扩增的DNA序列GC含量最高(59%),且在不同样本间ITS扩增的DNA序列GC含量差异最大,在57%~59%之间;(3)coxⅠ条形码序列可聚为两类,其中6个几乎不存在遗传距离,且5个样本间的遗传距离均小于50;从rbcL条形码序列的聚类结果看来,除了RQL3之外,其他样品聚为一类,6个样本间的遗传距离均小于50。ITS条形码序列聚类的结果显示,9种马尾藻样本可聚为两类,马尾藻样本之间均存在一定的遗传距离。研究认为,青葛港海域马尾藻种内变异丰富,同一属的样品表现出很好的属内种间多样性;在分析青葛港马尾藻的遗传进化时利用ITS基因比其他两种基因能发现更多的遗传变异,能有效分析马尾藻的遗传进化关系。该研究结果对研究马尾藻种群生长和遗传进化具有重要现实意义,可为人工培育优异马尾藻属及其选育打下基础。