基于RPA技术对转CP4-EPSPS基因产品的快速检测

核酸检测在农产品安全检测中的应用十分广泛,随着转基因作物的商业化种植,迫切需要一种快速、特异、灵敏的转基因作物检测方法。利用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术对含有转基因产品及其制品中CP4-EPSPS基因进行检测,共设计5对引物来筛取最佳引物,并对反应体系和反应温度进行优化。结果表明,该方法采用20μL体系在37℃恒温反应15 min即可对CP4-EPSPS基因进行快速检测。该方法检测转基因的灵敏度阈值为45拷贝,灵敏度高、特异性强,为大规模筛查CP4-EPSPS基因提供了一种新的途径。

基于农杆菌介导法将CP4-EPSPS基因转入玉米自交系B73的研究

【目的】建立玉米遗传转化体系培育抗除草剂玉米材料,解决玉米杂草危害问题。【方法】采用农杆菌介导法在玉米自交系B73幼胚中转入抗除草剂基因(CP4-EPSPS),通过PCR、qRT-PCR鉴定转基因植株;利用ddPCR技术筛选低拷贝转基因植株,并对低拷贝植株进行草铵膦抗性鉴定。【结果】在所获得的181株抗性植株中12株为阳性,转基因植株的外源抗除草剂基因(CP4-EPSPS)在转录水平上均能正常表达;转基因植株中筛选到低拷贝植株5株;抗性鉴定证明转基因植株均具有草铵膦抗性。收获T1代转基因低拷贝植株种子5份。【结论】建立了以B73为受体,基于农杆菌法介导的玉米遗传转化体系。

进口转基因抗草甘膦油菜籽和大豆中CP4-EPSPS基因的检测比较研究

由于国际上对转基因产品的安全性存在较大争议 ,因此对没有加施标签予以声明的情况下大量进入中国市场的转基因产品进行检测就显得十分迫切且意义重大。本研究以进口转基因抗草甘膦油菜籽和大豆为材料 ,通过比较分析外源的CP4 EPSPS基因的核苷酸序列和表达的氨基酸序列 ,设计出两对不同的引物 ,采用PCR方法分别对转基因油菜籽和大豆中外源的CP4

LAMP在检测转基因抗草甘膦大豆cp4-epsps基因上的应用

以转基因抗草甘膦大豆为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cp4-epsps合成酶基因(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase),在65℃保温30 min,通过荧光显色即可完成对转基因的检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cp4-epsps基因,其检测灵敏度是常规定性PCR方法的10倍。建立了针对转基因大豆cp4-epsps基因的LAMP检测方法,其具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,适合转基因抗草甘膦大豆的快速检测。

抗CP4-EPSPS单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的制备可用于胶体金快速检测试条的抗CP4-EPSPS(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以重组蛋白CP4-EPSPS免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CP4-EPSPS的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力,并进行mAb结合表位分析。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(Ⅲ5A3,Ⅲ13A2)。其抗体亚类均为IgG1;腹水效价分别为1∶106和1∶108;相对亲和力Ⅲ5A3在105以上,Ⅲ13A2在106以上。ELISA相加实验结果显示2株mAb识别相同或相近的抗原表位。结论成功地制备出抗CP4-EPSPS的2株mAb,为建立快速特异检测转基因植物(GMO)的实验方法提供了有力的工具。

棉花草甘膦抗性基因CP4-EPSPS的初步定位

以抗草甘膦陆地棉品系G-6和不抗草甘膦海岛棉品系海7124为试验材料,对分离世代进行检测,分析抗性基因的遗传规律;利用覆盖棉花26条染色体的234对核心引物,通过群体分离分析法进行差异性标记筛选,利用F2分离群体对抗性基因进行染色体定位。结果表明,抗草甘膦性状是受1对显性基因控制的质量性状。特异引物检测显示控制抗草甘膦性状的基因为人工合成基因CP4-EPSPS。利用筛选获得的27对多态性引物检测F2作图群体每个单株的基因型,发现分子标记NAU5417、NAU1339、BNL3992、BNL2448、NAU2140与目的基因CP4-EPSPS连锁。进一步筛选,共得到15个分子标记。参照现有的遗传图谱,推断目的基因CP4-EPSPS位于棉花第5染色体BNL2448与NAU2140之间,遗传距离分别为7.0 cM和16.2 cM。

CP4-EPSPS转基因棉花植株鉴定方法比较分析

CP4-EPSPS是从土壤农杆菌CP4菌株中分离得到的抗除草剂草甘膦基因,是转基因植物研究中最为常用的一种筛选标记基因。但是在CP4-EPSPS转基因植物后期筛选过程中仅凭简单的草甘膦抗性筛选并不能得到完全准确的鉴定结果,常会出现假阳性或漏选的情况。本研究以抗草甘膦转CP4-EPSPS基因棉花为材料,对PCR扩增、ELISA、CP4-EPSPS蛋白检测试纸条及草甘膦抗性四种转基因阳性植株筛选方法进行比较,从筛选结果的准确性、时效性、易用性及实惠性等不同方面综合分析了各种筛选方法的优缺点,结果表明ELISA、试纸条检测方法的准确性显著高于PCR检测与0.3%浓度草甘膦抗性检测,而试纸条检测操作更加便捷,因此建议将草甘膦抗性与试纸条检测方法结合起来使用。本研究结果为以CP4-EPSPS基因为标记筛选的转基因植物的室内及大田筛选提供实验依据。

转CP4-EPSPS基因大豆对大鼠的致突变研究

以SD大鼠为试验动物模型,分别饲喂含转CP4-EPSPS基因大豆和常规大豆饲料,以转基因大豆饲料饲喂大鼠为试验组,常规大豆饲料饲喂大鼠为对照组,择期进行精子畸变试验、显性致死试验和致畸试验。结果表明:试验组和对照组相比精子畸变率无显著差异(P>0.05),二者与阳性对照组差异显著(P<0.05);显性致死试验中试验组与对照组胚胎死亡率无显著差异(P>0.05);致畸试验中2组活胎同性别间的体质量、体长、尾长、前肢长度均无显著差异,经活胎外表检查、骨骼检查、内脏检查无畸形。结果说明,喂食转CP4-EPSPS基因大豆饲料对大鼠精子畸变、胚胎致死、胎仔畸形无不良影响,不存在生殖毒性。

CP4-EPSPS夹心ELISA配对单克隆抗体的研制和生物学特性分析

为获得能够用于夹心ELISA检测的配对抗CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体,构建CP4-EPSPS原核表达载体并转化大肠杆菌Rossetta,获得高效表达。通过对可溶性蛋白纯化,获得了高纯度目的蛋白。以纯化后的CP4-EPSPS蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和筛选获得2株抗CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体(1A5和8A3)。经鉴定,这2株抗体可以有效地识别高温变性和天然CP4-EPSPS蛋白;叠加ELISA分析表明两株抗体识别的抗原表位不同,说明两株抗体能够用于夹心ELISA检测CP4-EPSPS蛋白。

膨化对转基因豆粕CP4-EPSPS蛋白的影响

旨在研究转基因豆粕经挤压膨化后外源蛋白的变化规律。以CP4-EPSPS多克隆抗体和转基因含量为2%的大豆标准品作为材料,建立ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4-EPSPS蛋白的方法。结果表明,膨化豆粕中外源蛋白含量随着温度和含水率的升高逐渐降低,ELISA法检测低限达到0.25%,可以定量检测经过加工的转基因豆粕。

转基因大豆CP4-EPSPS蛋白的降解规律研究

随着转基因技术发展和应用,转基因外源基因表达蛋白在环境中富集和降解情况成为公众关注的问题,外源蛋白在环境中的检测和监测成为转基因研究和监管的一个方向。本研究利用模拟自然降解和蛋白酶K两种方式,处理转基因大豆种子(5%GTS 40-3-2),采用Western blot、双抗夹心快速检测试纸条和酶联免疫吸附测定(ELISA)等手段检测CP4-EPSPS蛋白降解情况,结果发现在模拟自然降解条件下,CP4-EPSPS蛋白呈现逐渐被降解的趋势,且在17周被彻底降解;蛋白酶K处理大豆匀浆情况下,9小时CP4-EPSPS蛋白被快速降解。该研究探索了CP4-EPSPS蛋白在自然环境下的降解规律,为寻求一种快速、安全、有效降解转基因CP4-EPSPS蛋白研究提供参考。

石英晶体微天平对CP4-EPSPs草甘膦抗性蛋白检测研究

为建立5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合酶(CP4-EPSPs)蛋白的石英晶体微天平(QCM)传感检测方法,采用在金片表面修饰抗原所对应的单克隆抗体的方法,利用QCM技术,对CP4-EPSPs蛋白进行检测研究。结果表明:该方法灵敏度达到500ng·mL-1,特异性好,重复性高,检测转基因玉米含量检出限为0.1%。该方法不足之处在于检测仪器不方便携带,在未来研究中考虑研发便携式QCM检测装置。

激光诱导荧光结合磁分离检测CP4-EPSPS基因

建立一种激光诱导荧光结合磁分离的检测技术,用于在线检测CP4-5-烯醇丙酮酸酯-3-磷酸合酶基因(CP4-5-enol acetate-3-phosphate synthase gene,CP4-EPSPS)。以氨基磁纳米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs)为载体修饰cDNA,构建捕获基因探针,并设计FAM荧光标记的信号基因探针(sDNA)。在目的基因CP4-EPSPS(tDNA)存在的情况下,cDNA和sDNA通过碱基互补配对原则与tDNA结合形成双链结构。该结构通过毛细管时被磁场富集分离,然后在激光诱导荧光检测器的作用下在线检测其荧光信号。通过对MNPs质量浓度、捕获探针浓度、牛血清白蛋白质量浓度进行考察,在优化的实验条件下,在1.0×10^(-11)~2.0×10^(-7)mol/L范围内,CP4-EPSPS基因浓度与荧光峰面积呈良好线性关系,检出限为4.0×10^(-12)mol/L(RSN=3),该方法成功应用于转基因大豆的聚合酶链式反应扩增产物的检测。

抗草甘膦转基因大豆Cp4-epsps基因快速简便的LAMP检测方法

针对抗草甘膦转基因大豆的外源基因Cp4-epsps,建立了一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的抗草甘膦转基因大豆的检测体系,其扩增产物既可利用常规琼脂糖凝胶电泳检测,还可通过SYBR Green I染色进行快速检测。LAMP检测体系中dNTPs浓度为0.8 mmol/L、Mg2+浓度为3mmol/L、反应时间为45min时扩增效果最佳,其检测灵敏度为5μg/L,比常规PCR灵敏100倍。田间实际检测结果表明,LAMP检测结果和PCR检测结果完全一致,准确率为100%。本研究所建立的抗草甘膦转基因大豆LAMP检测方法具有简便快速、特异性强、灵敏度高等特征,是一种能够用于抗草甘膦转基因大豆检测、田间基因漂移监测和环境安全研究的有力工具。

转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的检测及其表达特征研究

为了建立转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的免疫学检测方法,并了解其在水稻生长过程中的表达特征,本研究在大肠杆菌中表达了CP4-EPSPS蛋白质,纯化后以其为免疫原免疫小鼠,经筛选获得了可识别CP4-EPSPS的单克隆抗体。建立了用免疫印记技术检测转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的方法,该方法可以从单粒稻米的0.63%材料中检测到CP4-EPSPS信号。对水稻不同发育时期代表性组织的检测结果表明,CP4-EPSPS蛋白质呈组成型表达,在花药、穗轴、颖壳及不同时期的叶片中的表达量较高,但在分蘖期基部茎节、叶鞘及成熟期种子胚中的表达量稍低。本研究建立的免疫学方法在转基因水稻检测中具有潜在的应用价值。

CP4-EPSPS蛋白在大肠杆菌中的表达与制备

构建了一个含有CP4-EPSPS外源基因的细菌表达载体并在大肠杆菌Transtta菌株中的高效表达,通过SDS-PAGE检测发现,目标蛋白完全以可溶性方式存在于细胞破碎上清液中,且约占到细菌可溶性蛋白的40%左右。收集该上清液并进而通过连续2次镍柱亲和层析,CP4-EPSPS重组蛋白纯度可达99.9%以上,对其进行N端序列分析,与预期的结果完全一致。以其作为标准品,通过ELISA,成功检测出三株CP4-EPSPS转基因烟草中目标蛋白含量分别为0.292μg/g、0.477μg/g和0.703μg/g。该蛋白表达和纯化体系可为CP4-EPSPS转基因植物蛋白量值溯源传递的标准物质研制提供稳定物质基础。

农作物中Cry1A(c)和CP4-EPSPS转基因成分双重实时荧光PCR检测方法的建立

采用羧基荧光素(FAM)和六氯荧光素(HEX)荧光基团标记探针,建立针对农作物中常见抗虫和抗除草剂基因的双重实时荧光PCR检测方法,通过特异性、检出限以及模拟掺假试验验证此方法在转基因检测中的适用性。特异性检测试验中仅转基因作物(转基因棉花、转基因水稻、转基因大豆)和阳性质粒检测出相应转基因成分,其余样品均未出现明显PCR扩增曲线;检出限结果表明,双重实时荧光PCR方法对Cry1A(c)、CP4-EPSPS基因的检出限分别为1、0.1 ng,所建立的标准曲线r^(2)值均大于0.98,具有对农作物中的转基因成分进行定量检测的能力;模拟掺假检测显示此方法可检测到1%的Cry1A(c)和5%的CP4-EPSPS转基因成分。综上所述,本试验建立的双重实时荧光PCR法适用于对Cry1A(c)和CP4-EPSPS转基因成分的快速检测和定量分析。

CP4-EPSPS蛋白抗体的制备及其夹心ELISA定量检测方法的建立

为了快速高效地检测转Cp4 epsps基因抗除草剂大豆,本研究利用已制备的CP4-EPSPS蛋白免疫实验动物,获得5株CP4-EPSPS蛋白鼠单克隆抗体及3份羊抗血清,建立了CP4-EPSPS蛋白双抗夹心酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法,同时利用该方法对结荚期的Cp4 epsps转基因抗除草剂大豆的根、茎、叶、种子进行定量检测。结果显示,最佳检测条件为捕获抗体1D12,工作浓度1.25μg/mL,包被酶标板,4℃静置过夜,检测样品20℃孵育45 min,检测抗体8092,工作浓度2.5μg/mL,20℃孵育30 min;CP4-EPSPS蛋白在模拟大豆环境中最低检测限为3.6 ng/mL,检测范围为7.5~125 ng/mL;重复性变异系数小于15%。利用上述检测条件,在转Cp4 epsps基因抗除草剂大豆的根、茎、叶、种子中均检测到CP4-EPSPS蛋白的表达,且各组织部位表达量差异显著,其中CP4-EPSPS蛋白在叶片中表达量最高,茎、种子、根中CP4-EPSPS蛋白表达量逐渐降低。

重组抗原CP4-EPSPS的克隆、表达和纯化

构建了一个含有CP4-EPSPS外源基因的细菌表达载体并在E.coli BL21(DE3)中的高效表达,通过SDS-PAGE检测发现,目的蛋白完全以可溶性方式存在于细胞破碎上清液中。收集该上清液并进而通过镍柱亲和层析,CP4-EPSPS重组蛋白纯度可达85%以上,利用Brandford法测定蛋白质浓度为0.9 mg/m L。该蛋白表达和纯化体系可为转基因植物、食品等蛋白检测用抗体提供稳定免疫性抗原,同时也可为蛋白标准物质研制提供稳定物质基础。

第一、二代转cp4-epsps基因大豆鉴定方法的建立

【目的】建立一种广谱性鉴定第一、二代转cp4-epsp基因大豆的检测方法,为准确鉴定第一、二代转cp4-epsps基因大豆及其产品提供技术支持。【方法】根据第一、二代转基因大豆的cp4-epsp基因保守序列设计一对能同时鉴定两代转基因大豆外源基因cp4-epsps的引物和探针,建立一种广谱性鉴定第一、二代转cp4-epsps基因大豆的方法,并从准确性、特异性、灵敏性及重复性4个方面对该方法进行评估。【结果】设计的引物/探针对鉴定第一、二代转cp4-epsps基因大豆及其产品具有广谱性;建立的检测方法能检测到反应体系中低至5×100拷贝的cp4-epsps基因,Ct为38.88,且能同时检测出两代转基因大豆。准确性和特异性评估结果显示仅两代转cp4-epsp基因的大豆能被检测到;40次重复试验结果显示,反应体系中5×100拷贝的cp4-epsps基因片段的检出率为100%。【结论】建立的第一、二代转cp4-epsps基因大豆鉴定方法具有特异强、灵敏度高、重复性好、准确性高等特点,可用于转cp4-epsp基因大豆及其产品的监测。