CRELD1基因在汉族先天性房室隔缺损患儿中的突变分析

目的探讨CRELD1基因突变在房室间隔缺损(AVSD)发病机制中的作用。方法收集67例汉族AVSD患儿(包括合并21三体综合征10例)血液标本,PCR方法扩增CRELD1基因全部11个外显子编码序列后,对扩增产物进行测序,然后与GenBank人CRELD1基因编码序列进行比对,并以100名健康汉族人群为对照。结果在67例患儿中检出1例错义突变(碱基变化为G973A,氨基酸改变为E325K),为部分型AVSD伴21三体综合征的男性患儿;7例患儿发现基因多态性(rs 2302787,碱基变化C383G,氨基酸改变P128R);24例患儿发现基因多态性(rs 3774207,碱基变化C1119T,氨基酸编码H373H)。结论合并21三体综合征的AVSD患儿中,CRELD1基因突变的检出率(1/10例,10%)高于非综合征、散发的AVSD人群(0/57例,0%),但这一结论尚有待于更多的病例数证实;AVSD患儿中,CRELD1基因突变的检出率不高,提示AVSD可能是一个多基因的遗传性疾病。

CRELD1基因过表达对心脏瓣膜相关基质蛋白的影响

目的探讨CRELD1基因过表达对心脏瓣膜相关基质蛋白的影响。方法采用PCR技术获得CRELD1基因,利用质粒pcDNA3.1(-)构建目的基因的真核表达载体,酶切及DNA测序鉴定。利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染人胚肺成纤维细胞株(HFL-I)(重组质粒组),以空载体转染细胞和未转染细胞分别作为转染对照组和空白对照组。采用Real-TimePCR技术和Western blotting方法检测细胞中心脏瓣膜基质蛋白Tenascin-C和Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量。结果重组质粒测序鉴定结果与GenBank数据库比对序列一致。重组质粒组HFL-I中Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量均显著低于转染对照组和空白对照组(P<0.05);各组HFL-I中Tenascin-C的mRNA和蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 CRELD1基因过表达时可以下调人胚肺成纤维细胞中心脏瓣膜基质蛋白Aggrecan的表达量,为阐明CRELD1基因在房室间隔缺损中的作用提供了一定的理论基础。

CRELD1基因在房室间隔缺损发病机制中的作用

目的探讨先天性房室间隔缺损患者CRELD1基因的突变及其功能意义。方法应用PCR法扩增66例房室间隔缺损患者CRELD1基因的全部11个外显子及两侧各50个碱基以上的序列并进行DNA测序。构建含有突变位点的真核表达载体peDNA3．1-CRELD1。采用Western印迹及实时荧光定量逆转录一PCR检测CRELD1、Tenascin-C和Aggrecan的蛋白及mRNA表达水平。结果1例部分性房室间隔缺损患者C857G碱基变化，使位于第8外显子上第一钙结合EGF区域286位点精氨酸被脯氨酸替代（P286R）。Western印迹和实时荧光定量逆转录-PCR检测结果显示，CRELD1基因P286R突变后表达增强。与空载对照相比，野生型和突变型Aggrecan的mRNA表达均下调（t值分别为140．27，26．36，P〈0．01），但突变型与野生型之间的Aggrecan表达差异存在统计学意义，突变型下调更为明显（t=-25．69，P=0．002）。Tenascin-C在野生型和空载组的表达差异无统计学意义（t=1．167，P〉0．05），但突变型的Tenascin-C表达明显增强（t=6．66，P=0．022）。结论CRELD1基因错义突变是房室间隔缺损发病的高风险易感因素。P286R突变可使基因功能增强，并影响细胞外基质蛋白Aggrecan和Tenascin-C的表达水平，与房室间隔缺陷发病有密切关系。

CRELD1基因表达量对心内膜垫发育中相关基因的影响

目的探讨CRELD1基因表达量的改变对心内膜垫发育中相关基因的影响。方法通过慢病毒载体的构建实现CRELD1基因的过表达及沉默，然后用慢病毒载体感染人胚胎肺成纤维细胞（HFL-I），实验分为5组：空白对照组、干扰阴性对照（NC）组、干扰组、过表达NC组及过表达组。感染成功后，分别用实时荧光定量PCR（qPCR）和Western blot检测CRELD1、Sox9、Aggrecan和Scleraxis、Tenascin-C的mRNA和蛋白表达。结果通过测序表明干扰载体pLV3-shRNA-CRELD1和过表达载体pLV4-CRELD1构建成功。感染慢病毒的HFL-I在荧光倒置显微镜下观察，满视野呈现明显的绿色荧光，表明感染成功。qPCR和Western blot的检测结果一致：Sox9和Aggrecan的表达量在干扰组明显高于干扰NC组，在过表达组低于过表达NC组。而Scleraxis干扰组和过表达组均高于各自的NC组。Tenascin-C的表达量在干扰组明显低于干扰NC组，在过表达组高于过表达NC组。结论CRELD1基因对心内膜垫发育中的相关基因Sox9和Aggrecan的表达量有负调节作用，对Tenascin-C的表达量有正调节作用。这对于阐明其在房室间隔缺损中的作用提供一定的理论基础。

先天性房室间隔缺损的遗传学进展

先天性房室间隔缺损（atrioventricular septal defect，AVSD）是一种常见的心血管畸形，由于存在房室间隔（房间隔下部、窒间隔上部）以及中央心内膜垫组织的缺损，造成左右心腔之间的异常交通。虽然AVSD的胚胎学、病理生理学以及诊断和治疗目前都已基本阐明，但其确切的发病机制仍无突破性进展。随着分子生物学技术的广泛应用以及分子遗传学研究的深入开展，AVSD在遗传学的研究中取得一系列新进展，一些基因被证实与AVSD的发生发展存在一定的相关性。