绿色杜氏藻类胡萝卜素异构酶(CRTISO)的基因生物信息学与转录差异研究

类胡萝卜素异构酶(Carotenoid isomerase,CRTISO)是类胡萝卜素生物合成途径中催化番茄红素由顺式结构向反式结构转变的关键异构酶。利用转录组测序获得绿色杜氏藻crtiso c DNA全长序列,进行生物信息学分析,并研究乙酰水杨酸(ASA)、花生四烯酸(AA)处理绿色杜氏藻后该基因转录差异与类胡萝卜素含量变化情况。生物信息学结果表明:绿色杜氏藻crtiso c DNA全长1176 bp,开放阅读框(ORF)长度为795 bp,编码264个氨基酸。该蛋白质的理论相对分子质量为29 522.6,理论等电点(PI)为5.86,该蛋白为稳定蛋白与亲水性蛋白,无信号肽和跨膜区域,定位于细胞质基质。氨基酸序列同源性比对结果表明其与小球藻的类胡萝卜素异构酶同源性最高,达到78%。RT-q PCR结果表明,AA、ASA诱导后,该基因表达量均呈现先升高后降低的趋势,且当AA、ASA质量浓度分别为62.5 mg/L、50 mg/L时表达量最高。类胡萝卜素含量大致呈现逐渐升高的趋势。当AA、ASA质量浓度分别为312.5 mg/L、100 mg/L时,类胡萝卜素含量达到最高。即该基因与类胡萝卜素含量呈一定相关性。

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶(Carotenoid isomerase,CRTISO)基因的功能,从普通烟草(Nicotiana tabacum)的c DNA中成功克隆出CRTISO基因编码区(CDS)全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯(Solanum tuberosum)和番茄(Solanum lycopersicum)的前番茄红素异构酶(Prolycopene isomerase)基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)载体中,构建重组载体p TRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)系统抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,p TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶(ε-LCY)、番茄红素β环化酶(β-LCY)和胡萝卜素β-环羟化酶(β-OHase)基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。

大白菜橘红心类胡萝卜素组分及其基因分析

利用高效液相色谱法(HPLC),根据二极管阵列检测器和标准品的检测结果对橘红心和白心大白菜内叶类胡萝卜素组分进行鉴定;以橘红心大白菜自交系‘A21530’和白心大白菜自交系‘A21445’为亲本构建了一个269单株的F2分离群体,进行橘红心基因精细定位;根据大白菜基因组注释信息,筛选橘红心候选基因并克隆测序分析;基因内部开发标记,在F2群体进行候选基因验证。研究结果表明,橘红色是由于前番茄红素(7,9,7′,9′–四顺式–番茄红素)、9–顺式–β–胡萝卜素、前链孢红素(7,9,9′–三顺式–链孢红素)和其他胡萝卜素组分积累造成的。通过精细定位将橘红心基因定位于A09号染色体末端,其两侧紧密连锁的标记是SB13037和SB13049,这两个标记各有一个重组单株,与橘红色基因分别相距0.3和1.1 cM,物理距离为98.904 kb。根据大白菜基因组注释信息,分析定位区域的23个基因,筛选出1个编码类胡萝卜素异构酶的基因CRTISO,基因编号Bra031539。测序结果表明,Bra031539的编码区有53个SNP和6个碱基缺失,造成12个氨基酸突变和2个谷氨酸的缺失。根据缺失突变位点设计标记,在F2群体中进行验证,结果表明候选基因与橘红心性状共分离。