成年小鼠触液神经元体外分离培养及自我更新能力的鉴定

背景:课题组前期成功在体外分离培养乳鼠触液神经元,尚无研究报道有效分离培养高纯度成年小鼠触液神经元的方法,且触液神经元的自我更新能力是否随着年龄发生变化尚无研究。目的:建立一种高纯度成年小鼠触液神经元体外分离培养的方法,并鉴定成年小鼠触液神经元与乳鼠触液神经元在体外的自我更新能力。方法:从成年3月龄小鼠颈髓分离含有触液神经元的原代细胞贴壁培养并利用融合多模态成像基因的慢病毒转染细胞,通过嘌呤霉素筛选得到高纯度成年小鼠触液神经元细胞,在完全培养基中悬浮培养。通过免疫荧光检测成年小鼠触液神经元表达神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)及SOX2情况,观察成年小鼠触液神经元体外成球与传代能力;将同等数量(5×10^(3))的第3代成年小鼠及乳鼠触液神经元在同等条件下分为2组,分别接种在含有完全培养基的超低黏附培养板中,在体积分数5%CO_(2),37℃恒温箱悬浮培养,通过体外成球、CCK8实验、qPCR和Western blot鉴定成年小鼠及乳鼠触液神经元的自我更新能力。结果与结论:①实验成功在成年小鼠体内分离出高纯度触液神经元,在体外表达Nestin及SOX2,能形成神经球并连续传代。②成年小鼠触液神经元体外自我更新能力较乳鼠相比明显减弱,细胞培养到第4天时乳鼠触液神经元已经形成直径约为150μm的神经球,而成年小鼠触液神经元所形成的神经球直径仅为40μm(P<0.0001)。③CCK8增殖实验结果表明,成年小鼠触液神经元的增殖活性在培养后各时间点显著弱于乳鼠(P<0.0001)。④qPCR和Western blot检测发现成年小鼠触液神经元Nestin及SOX2的mRNA(P<0.0001)和蛋白表达量(P<0.01)较乳鼠显著下降。⑤上述结果证实,成年小鼠触液神经元的体外自我更新能力显著弱于乳鼠。

Extracellular matrix and biomimetic engineering microenvironment for neuronal differentiation

Extracellular matrix(ECM)influences cell differentiation through its structural and biochemical properties.In nervous system,neuronal behavior is influenced by these ECMs structures which are present in a meshwork,fibrous,or tubular forms encompassing specific molecular compositions.In addition to contact guidance,ECM composition and structures also exert its effect on neuronal differentiation.This short report reviewed the native ECM structure and composition in central nervous system and peripheral nervous system,and their impact on neural regeneration and neuronal differentiation.Using topographies,stem cells have been differentiated to neurons.Further,focussing on engineered biomimicking topographies,we highlighted the role of anisotropic topographies in stem cell differentiation to neurons and its recent temporal application for efficient neuronal differentiation.

Evaluation of three tracers for labeling distal cerebrospinal fluidcontacting neurons

It has been reported that distal cerebrospinal fluidcontacting neurons（dCSF-CNs）can be detected by immunohistochemical assay using cholera toxin subunit B-conjugated horseradish peroxidase（CBHRP）.In the present study,another two methods with CB alone or CB-conjugated FITC（CB-FITC）were used,and the results from the three methods were compared.Adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups with CB-HRP,CB or CB-FITC.Tracers were diluted to 30%in artificial cerebrospinal fluid and injected separately（in a volume of 3μL）into the lateral ventricle.Animals from the CB-HRP and CB groups were perfused 48 h after surgery while animals from the CB-FITC group were perfused 1,3,6,12,24 or 48 h after surgery.The brain was sectioned（40μm）for immunofluorescence and five sections with positive neurons were selected from each rat for neuron counting.Three clusters of positive neurons in a＇Y-like＇distribution were detected ventral to the cerebral aqueduct of rats from the three groups.No significant difference was observed among the quantitative data.In the CB-FITC group,stable staining was detected even at 6 h after injection.Taken together,lateral ventricle injection of CB/CB-FITC is a useful method for labeling dCSFCNs in rats.The CB-FITC method makes dCSF-CNs labeling much simpler and more convenient.

基于多层脉冲神经网络的非接触液位检测方法

尽管基于深度学习的非接触液位检测方法能够较好地完成检测任务,但其对计算资源的较高要求使其不适用于算力受限的嵌入式设备。为解决上述问题,该文首先提出了基于多层脉冲神经网络的非接触液位检测方法;其次,提出了单帧和帧差脉冲编码方法将视频流时间动态性编码成可重构的脉冲模式;最后在实际场景中对模型进行测试。实验结果表明,所提方法具有较高应用价值。

多模态影像分子体外验证触液神经元的神经干细胞特性

背景:最近研究发现位于脊髓中央管附近的接触脑脊液神经元(简称触液神经元)具有神经干细胞潜能,但触液神经元在体外研究中纯度不高,且目前尚无体外示踪技术证明其神经干细胞特性。目的:通过多模态影像分子筛选并在体外验证触液神经元的神经干细胞特性。方法:根据触液神经元特异性表达Pkd2l1基因,针对Pkd2l1基因上游启动子设计一种使触液神经元特异性表达绿色荧光蛋白(GFP)的多模态影像分子慢病毒(Lentivirus-Pkd2l1-GFP-puromycin-luciferase)。从出生24 h内C57BL/6小鼠延髓组织中提取出原代神经干细胞贴壁培养,用多模态影像分子病毒转染含有触液神经元的原代神经干细胞,通过嘌呤霉素筛选并纯化触液神经元。对筛选纯化的触液神经元进行体外悬浮培养并连续传代4代以上,免疫荧光检测第3代触液神经元与神经干细胞标记物Nestin、Sox2共表达情况。通过对第3代触液神经元诱导分化培养,免疫荧光检测触液神经元与神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4的共表达情况。结果与结论:成功构建出多模态影像分子慢病毒,并且筛选纯化后的触液神经元能够存活、增殖并表达绿色荧光蛋白。绿色荧光蛋白阳性触液神经元能在体外连续传代4代以上,并表达神经干细胞标记物Nestin、Sox2。诱导分化后,绿色荧光蛋白阳性触液神经元表达神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4。结果表明:多模态影像分子病毒能特异性标记触液神经元,触液神经元在体外具有自我更新、多向分化能力,通过多模态影像分子在体外成功验证触液神经元具有神经干细胞特性。

大鼠远位接触脑脊液神经元的追踪研究

将CB-HRP引入大鼠A组(侧脑室)和B组(第四脑室)。结果:1.A组:(1)在各接触脑脊液部位均见有CB-HRP颗粒标记。(2)自室壁发出的标记纤维见于尾壳核、终纹床核、弓状核、室周核、正中隆起、下丘脑背内侧核、下丘脑腹内侧核、第四脑室底灰质。(3)远位的标记神经元见于隔外侧核、丘脑前背侧核、乳头体下核、中缝背核、第四脑室底灰质和外侧下橄榄核。(4)部分脑神经根被标记,但其相应核团未见标记细胞。2.B组与A组的不同:(1)中脑水管上段.第三脑室、侧脑室未见有标记结构,(2)在中缝背核和第四脑室底可见到少量标记细胞。

北京鸭下丘脑与摄食行为的关系 Ⅱ.5-羟色胺样神经元在下丘脑的分布PAP法研究

用免疫组化ＰＡＰ法，观察了经秋水仙素预处理的北京鸭下丘脑内５－羟色胺（５－ＨＴ）样神经元的分布。结果，５－ＨＴ样神经元仅散在分布于下丘脑室周器（ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｏｒｇａｎ，ＰＶＯ）内，下丘脑室周器腹侧部的５－ＨＴ样神经元数量多于背侧部；阳性反应细胞体呈多角形、椭圆形或棱形，常聚集在血管周围，有突起伸向第Ⅲ脑室内表面。推测北京鸭下丘脑室周器存在含５－ＨＴ的触液神经元。

中缝背核内远位触液神经元超微结构及其与周围组织的联系

目的观察中缝背核内远位触液神经元的超微结构及其与周围组织的联系,为探讨该类神经元的功能奠定形态学基础。方法使用霍乱毒素亚单位B与HRP结合物(CB-HRP)-电镜法。结果1.中缝背核内远位触液神经元具有一般神经元的形态及各种细胞器结构;2.CB-HRP沉淀物主要分布在触液神经元高尔基复合体的trans面以及溶酶体内;3.触液神经元与其他中枢神经元之间存在着方向相反的两种突触联系。结论1.中缝背核内远位触液神经元在形态及细胞器构成上与其他中枢神经元未见明显不同;2.其高尔基复合体和溶酶体在摄取外来物质的代谢和转运过程中可能存在特殊功能;3.该类神经元可以在中缝背核与脑脊液之间起到双向传递的作用。

室旁核胆囊收缩素神经元的电镜免疫细胞化学研究

本文应用电镜免疫细胞化学方法,研究了大鼠下丘脑室旁核胆囊收缩素(CCK)神经元的超微结构分布和突触联系。结果表明:CCK样免疫反应产物定位于大颗粒囊泡、胞浆基质、小透亮囊泡周围、粗面内质网及线粒体膜上。CCK阳性神经元为大细胞或小细胞,主要分布于室旁核的内侧部、室管膜下区和毛细血管周围。某些阳性胞体作为突触后成分与CCK阴性的轴突末梢形成轴体突触。CCK阳性树突和轴突分布于整个室旁核内。某些阳性树突和轴突作为突触后成分,与CCK阴性结构形成轴树和轴轴突触。某些CCK阳性轴突末梢围绕毛细血管。另一些CCK轴突末梢作为突触前成分分别与CCK阴性细胞形成轴体、轴树和轴轴突触。此外,作者首次发现CCK阳性树突穿过室管膜直接与第三脑室的脑脊液接触,CCK阳性轴突末梢走行于靠近室管膜的第三脑室腔内。上述结果提示:1.室旁按内CCK神经元的胞体、树突和轴突与非CCK神经元可能形成局部神经回路;2.室旁核内CCK神经元与血管之间可能存在神经-血管回路;3.室旁核内接触脑脊液的神经元,可参与形成脑-脑脊液神经体液回路,并通过脑脊液影响和调节远位靶区的机能活动。

人胎儿脑室系统接触脑脊液神经元的扫描电镜观察

用扫描电镜较全面地观察了人胎儿脑室系统──侧脑室、第三脑室和第四脑室壁的超微结构。结果发现人和某些动物一样，几个脑室室管膜表面都覆盖着大量的纤毛和微绒毛。纤毛的分布在区域上有一定的差别。并证实了３个脑室内存在着接触脑脊液神经元的胞体、树突和轴突。该神经元的胞体为梭形或球形，可见到一个或两个以上的突起。室管膜上神经纤维发自神经细胞或自室腔外穿入而来。另外，在室管膜上还观察到了神经胶质样细胞和类组织细胞。神经胶质样细胞呈不规则球形，表面比较光滑，有较多的丝状或棘状突起自胞体伸出，没有轴突和树突之分。类组织细胞，大多呈球形，表面有微绒毛或泡状结构，突起较少。在某些区域还可见其聚集成群。本文并对上述各种结构的功能进行了讨论。

中缝背核远位触液神经元与脑实质之间超微结构的联系

目的：研究大鼠中缝背核内远位触液神经元与脑实质结构之间的超微结构联系，以探明这种神经元传递信息的方向。方法：用霍乱毒素亚单位Ｂ与辣根过氧化物酶复合物（ＣＢ－ＨＲＰ）顺、逆行追踪与电镜技术相结合。结果：中缝背核的触液神经元（以“＋”表示）与脑实质的非触液神经元（以“－”表示）之间主要有两种突触形式：轴（－）－树（＋）突触和树（－）－树（＋）突触，标记的树突多成簇状分布，有的形成树突中心球样的结构，在第三脑室侧壁尚见有被标记的轴突终末伸入脑脊液中。这些突触既有 ＧｒａｙⅠ型（兴奋型），也有 Ｇｒａｙ Ⅱ型（抑制型），但它们的共同特点是突触前成分均为非触液神经元的结构构成，突触后成分均为触液神经元的结构构成。结论：中缝背核的远位触液神经元既可以接受兴奋性信息，也可以接受抑制性信息，并将这些信息自脑实质向脑脊液方向传递。

第三脑室接触脑脊液神经元的扫描、透射和免疫电镜研究

本文应用扫描、透射和免疫电镜方法较全面地观察、比较和验证了大鼠第三脑室内的接触脑脊液神经元。实验结果表明:在第三脑室内存在接触脑脊液的神经元胞体、树突和轴突。神经元胞体为多角形、锥体形或梭形,具有神经细胞的结构特征,并首次在透射电镜下发现大鼠第三脑室内存在双极神经元。树突穿过室管膜细胞之间伸入第三脑室,末端呈蕈状或杵状膨大。轴突穿行于脑室内,含有突触囊泡。本文首次在超微结构水平证实第三脑室内接触脑脊液的树突和轴突末梢呈胆囊收缩素免疫反应阳性。上述实验结果为解释脑—脑脊液神经体液回路提供了超微结构基础。

大鼠远位触液神经元一氧化氮合酶的表达及其与吗啡戒断的关系

目的观测神经元型一氧化氮合酶（nNOS）在大鼠远位接触脑脊液神经元（CSF—CNs）中的表达，探索nNOS远位触液神经元在吗啡依赖和戒断形成过程中的作用。方法♂成年SD大鼠（260±20）g，侧脑室引入30％霍乱毒素亚单位B与辣根过氧化物酶复合物（CB—HRP）追踪定位鉴别远位触液神经元。取材相关部位，连续冠状冰冻切片，TMB—ST法行CB—HRP呈色反应，进一步nNOS免疫组织化学双重标记。行为学观测并计数各组动物相同层面脑片上CB—HRP和CB—HRP／nNOS两种标记细胞的表达情况。结果戒断组大鼠，戒断症状及总评分较对照组和吗啡依赖组大鼠差异有显著性（P〈0．01）；给NOS抑制剂组戒断症状评分较戒断组明显降低（P〈0．05）。各组动物脑片恒定部位出现CB—HRP阳性标记神经元，差异无显著性。正常组、对照组及依赖组计数到约3％～8．0％的CB—HRP／nNOS双标记神经元，差异无显著性；戒断组大鼠计数到56．9％的CB—HRP／nNOS双标记神经元，较对照组及依赖组明显增加（P〈0．01）；NOS抑制剂组大鼠计数到32．0％CB—HRP／nNOS双标记神经元，较戒断组CB—HRP／nNOS双标记神经元明显减少（P〈0．05）。结论大鼠脑实质内存在nNOS远位触液神经元，nNOS远位触液神经元可能参与了吗啡戒断的形成。

大鼠中缝背核及中缝正中核内的VIP、GABA样触液神经元

本文将ＣＢ－ＨＲＰ注入侧脑室，用ＣＢ－ＨＲＰ逆行迫踪与免疫细胞化学相结合的方法，对大鼠脑干内的中缝背核及中缝正中核的远位触液神经元进行了定性研究。结果表明：中缝背核内存在ＶＩＰ样、ＧＡＢＡ样免疫反应阳性的触液神经元；中缝正中核内亦存在少量ＶＩＰ样、ＧＡＢＡ样免疫反应阳性触液神经元。它们的形态和数量各异。本文首次报道中缝背核和中缝正中核内远位触液神经元的化学性质，为探索其机能意义提供了形态学依据。

有序聚甲基丙烯酸甲酯电纺纳米纤维作为大鼠背根神经元负载支架的可行性研究

目的探讨具备有序或无序拓扑结构的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)电纺纳米纤维材料作为原代大鼠背根神经元(dorsal root ganglion neurons,DRGn)负载支架的可行性。方法构建具有随机或有序拓扑结构的PMMA电纺纳米纤维;利用PMMA薄膜组作为对照,分离纯化大鼠原代DRGn,利用慢病毒技术转染绿色荧光蛋白基因作为显色手段,分析在随机及有序纤维支架上DRGn神经突的生长能力以及神经突和电纺纤维的依存关系。结果大鼠原代DRGn能够顺利在PMMA材料上贴壁并生长,在培养第2天,较之平面环境,DRGn未见平均神经突数量及神经突长度的明显区别,电纺纤维的拓扑结构对于DRGn神经突的生长具有明显的接触引导作用,在有序电纺纤维上DRGn能够生成和基质纤维延伸方向一致的神经突;通过GFP表达与背景纤维的合成图,发现在随机或有序电纺纤维上,DRGn神经突均能循纤维向前生长,但相比随机纤维,神经突似乎更倾向于接受有序电纺纤维的引导。结论有序PMMA电纺纳米纤维具有作为神经损伤后大鼠DRGn负载支架的潜力。

黑质多巴胺触液神经元

将30％ HRP 8—10μl或3％碘化丙啶(PI)3μl分别注入两组动物单侧侧脑室内,48小时后将鼠处死,检查中脑切片。发现双侧黑质均司见HRP标记细胞群,但以同侧为主。标记范围以中脑中上部为多。标记细胞主要分布在黑质致密带内侧部,网状带中仅少数散在。注射PI例所见类同,但标记细胞远较HRP标记细胞为多。TH免疫组化法发现黑质DA神经元投射纤维分散布于尾壳核,并见TH阳性投射纤维在室管膜上皮细胞的深面形成密集的膨大,个别地区还见阳性终末突入侧脑室。另外,在接受胚中脑黑质移植存活良好的受体鼠纹状体中,发现少数移植存活的TH阳性黑质DA神经元胞体或其突起伸入侧脑室室管膜上皮细胞间甚或突入室腔。实验表明部分黑质多巴胺神经元系触液神经元,提示可能直接释放DA入脑脊液。当胚黑质细胞被移植入受体脑纹状体后,部分黑质DA神经元重演其发育的规律,将其突起或胞体伸入室管膜上皮细胞间或突入侧脑室,以代偿其原有的功能。

鞘内注射左旋布比卡因下调甲醛炎性痛大鼠远位触液神经元P物质的表达

目的观察鞘内注射左旋布比卡因对甲醛炎性痛大鼠P物质（substance P，SP）在脊髓背角及远位触液神经元（the distal cerebrospinal fluid contacting neuron，dCSF-CN）表达的影响。方法采用CB-HRP大鼠侧脑室注射示踪标记dCSFCN；48h后先鞘内注射0．5％左旋布比卡因10μl（并以鞘内注射10μl人工脑脊液作对照），大鼠左后掌足跖部皮下注射2．5％福尔马林建立炎性痛模型，记录大鼠舔足时间，1h后测定机械缩足阚值（mechanical withdrawal threshold，MWT）评估机械痛敏；免疫组织化学光镜镜检及免疫电镜镜检P物质在脊髓背角（L4-5，）及dCSF-CN的表达。结果鞘内注射左旋布比卡因减少大鼠福尔马林试验的舔足时间（P〈0．01），MWT值无变化（与基础值对比，P〉0．05），sP在脊髓背角及dcSF．CN的表达弱于对照组（P〈0．01）。结论鞘内注射左旋布比卡因减低脊髓伤害性疼痛反应及下调SP在dCSF-CN的表达。

大鼠第三脑室室周区一氧化氮合酶阳性触液神经元的分布

目的 :观察大鼠第三脑室室周区 ( 3 V- Pe)内一氧化氮合酶 ( NOS)阳性触液神经元 ( CSFCN)的形态及分布特征 ,为了解一氧化氮 ( NO)在脑 -脑脊液神经体液回路中的调节作用提供形态学资料。方法 :用黄递酶组织化学染色方法研究 NOS神经元在大鼠 3 V- Pe的分布及其形态特点。结果 :3 V- Pe均有 NOS- CSFCN分布 ,由前腹侧渐向后背侧过渡。细胞可分 4种类型 ,位于室管膜内或其下层 ,或距之有一定的距离 ,但有突起伸向第三脑室。室旁核内有众多 NOS阳性纤维向第三脑室伸展 ,与 3 V- PeNOS- CSFCN相互交错、邻接。结论 :3 V- Pe NOS- CSFCN与脑脊液非常接近 ,提示它们自脑脊液获得信息 ,并能向脑脊液分泌NO,很可能具有神经

大鼠脑实质内远位触液神经元中5-HT_(1A)受体的分布及其在神经病理性痛中的表达

本文旨在探讨大鼠脑实质内远位触液神经元中5-HT1A受体的分布及其在神经病理性痛中的作用。慢性结扎损伤坐骨神经建立大鼠神经病理性痛模型,分别以缩足潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)和缩足阈值(paw withdrawal threshold,PWT)对大鼠热痛敏和机械触诱发痛反应进行评分,以可靠CB-HRP(cholera toxin subunit B with horseradish peroxidase)法追踪标记脑实质内远位触液神经元,用CB-HRP/5-HT1A受体免疫组织化学双重标记技术定位、鉴别5-HT1A受体在远位触液神经元中的表达,并计数分析5-HT1A受体分布和表达变化与痛行为表现之间的关系。结果表明,在神经病理性痛第1、3、7、14天,大鼠的PWL分别为19.37±2.74、12.04±1.77、8.74±1.15、12.31±1.94,PWT分别为18.58±3.62、13.05±1.81、6.66±1.43、11.55±2.01。CB-HRP标记细胞出现的位置和数量恒定。每只动物CB-HRP/5-HT1A受体双重标记的细胞数量分别为276.14±36.00、161.72±28.41、108.64±6.81、139.76±44.64,分别占该动物CB-HRP标记细胞总数的95%、60%、40%和55%。与对照组相比,神经病理性痛大鼠PWL、PWT及CB-HRP/5-HT1A受体双标细胞数均有显著性差异(P<0.01)。结果提示,大鼠脑实质的特定部位恒定存在远位触液神经元,该类神经元大多含有5-HT1A受体,该受体的表达与神经病理性痛行为表现之间呈负相关关系。

毁损大鼠中缝背核内触液神经元对吗啡依赖和戒断的影响

目的:探索脑内远位触液神经元在吗啡依赖和戒断形成过程中的作用。方法:化学性神经元毁损、侧脑室引入霍乱毒素亚单位B与辣根过氧化物酶复合物(CB-HRP)神经示踪、TMB-ST呈色反应,Western blot、nNOS免疫组织化学。结果:毁损大鼠中缝背核内远位触液神经元后,纳洛酮催促的戒断症状明显减弱,戒断症状评分较戒断未毁损组降低约38%(P<0.05);给予溶媒和毁损触液神经元旁侧的大鼠戒断症状与戒断组比较未见明显变化(P>0.05)。毁损组脑片触液神经元密集区局部细胞损坏明显,仅在其毁损区边缘观测到少量CB-HRP阳性细胞。未毁损组CB-HRP标记细胞位置及数量恒定,形态清晰。毁损触液神经元后,脊髓背角nNOS阳性神经元计数及nNOS蛋白表达较戒断未毁损组减少明显(P<0.05),而较正常组和依赖组增加仍显著(P<0.01)。结论:毁损大鼠中缝背核内部分远位触液神经元可减弱吗啡戒断症状和脊髓背角神经元型一氧化氮合酶的表达,提示中缝背核内部分远位触液神经元可能参与了吗啡依赖和戒断的形成,NO介导脑内触液神经元与脊髓水平对吗啡依赖和戒断的调节。