2021—2023年湖南省无害化处理场CSFV、PRV、PRRSV污染情况调查

为了解湖南省2021—2023年无害化处理场猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)污染情况,采用RT-qPCR方法对采集的1825份淋巴结、脾脏、耳尖等组织样品进行CSFV、PRV、PRRSV核酸检测,并对2022年衡南县PRRSV阳性样品进行分型检测及Nsp2基因测序。结果显示:CSFV、PRV、PRRSV的阳性检出率分别为3.01%、1.81%、30.14%;双重污染率为2.52%,以PRRSV与其他2种病原双重污染为主,三重污染率较低,为0.05%。2022年衡南县无害化处理场的PRRSV阳性检出率为24.12%,以春、冬季阳性率较高;北美型(NA-PRRSV)、高致病型(HP-PRRSV)、类NADC30毒株(NADC30-like)阳性检出率分别为98.39%、20.97%、43.55%;经Nsp2基因测序,1条序列存在“1+29”个不连续氨基酸缺失,为HP-PRRSV毒株,17条序列存在“111+1+19”个不连续氨基酸缺失,为类NADC30毒株。结果表明:2021—2023年,湖南省无害化处理场CSFV、PRV污染率维持在较低水平,PRRSV污染率较高,呈逐年上升趋势,其中类NADC30毒株为优势流行毒株,建议持续做好猪瘟及猪伪狂犬病的免疫接种及效果评估工作,加强PRRSV的遗传变异监测及养殖场的饲养管理和生物安全管理,以保障猪群生产安全。

PRRSV、CSFV、PRV和PCV2四重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Man探针,并进行反应体系优化,敏感性、特异性验证,建立了同时检测上述4种病原的四重实时荧光定量PCR。结果显示,所建立的四重荧光PCR扩增效率(E)、相关系数(R^(2))及曲线斜率均在正常范围内,检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2 E值、R^(2)、斜率分别为92.9%、0.998、-3.504,90.7%、0.998、-3.566,94.3%、0.996、-3.466,94.2%、0.997及-3.470。PRRSV、CSFV、PRV、PCV2重组质粒最低检出限分别达到10^(2)、10^(2)、10^(2)、10^(3) copies/μL;四重qPCR反应体系中的多条引物间不发生交叉反应,经评价该方法特异性良好;批内和批间重复性试验结果显示,变异系数(CV)均在1%以下,具有良好的重复性。分别使用该方法和相应的国标荧光定量检测法对采集的298份临床样品进行检测对比,两种方法检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2阳性符合率分别为96.08%、96.38%、100%、94.95%,均在94%以上。结果表明,建立的检测方法方便、灵敏、高效、特异性强,适用于猪呼吸道疾病病原学、流行病学研究以及临床病例的诊断,并为猪呼吸道疾病的预防和控制提供技术支撑。

PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的免疫原性分析

本试验旨在构建以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟双价基因工程亚单位疫苗候选株。利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF5-E2。该重组病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM。对重组病毒进行Western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验以及淋巴细胞增殖试验。Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组GP5和E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP5和E2蛋白;免疫金电子显微镜观察表明,重组GP5和E2蛋白展示在杆状病毒囊膜上;动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSV和抗CSFV的特异性抗体;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答。本试验成功构建表面展示PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和CSFV的混合感染奠定基础。

多重RT-PCR同时检测CSFV、PRRSV、HP-PRRSV方法的建立及其临床应用

根据猪瘟病毒(CSFV)P120基因及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Nsp2基因缺失区两端的保守区分别设计合成1对特异性引物,建立了一种简便、快速、同时鉴别检测CSFV、PRRSV、HP-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法扩增CSFV基因组时可获得508bp的片段,扩增PRRSV时可获得320bp的片段,扩增HP-PRRSV基因组时可获得230bp的片段,因此,根据多重RT-PCR产物大小可将三者区分开来。利用建立的多重RT-PCR方法,对50份临床可疑病料进行检测,结果发现,CSFV阳性率为8%,PRRSV阳性率为18%,HP-PRRSV阳性率为22%,而CSFV和HP-PRRSV混合感染阳性率达2%,PRRSV和HP-PRRSV混合感染阳性率达16%,说明所建立的多重RT-PCR方法简便、快速、特异,可同时鉴别CSFV、PRRSV及HP-PRRSV,亦可用于感染这3种病毒的临床病料的快速鉴定和分子流行病学调查。

多重PCR检测CSFV和PRRSV与PCV2

根据GenBank上猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的已发表序列,分别设计并合成了3对特异性扩增引物,建立CSFV、PRRSV和PCV2单项PCR检测方法,分别扩增出预期的466 bp、202 bp和706 bp片段。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了CSFV-PRRSV-PCV2多重PCR检测方法,为预防和控制上述三种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。

某猪场CSFV、PRRSV、PCV2和PRV多重感染病例的报道

贵州省某种猪场一周内连续发生30余头母猪早产和(或)产死胎症状,猪场工作人员向笔者实验室送检同窝流产死胎4只。根据流行情况和临床特征,初步判断与病毒感染有关。为筛查具体病原,本实验室将送检死胎组织混合样品分别对CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV和JEV六种常见病毒进行病原核酸检测,结果显示该猪场发病猪存在CSFV、PRRSV、PCV2和PRV的多重感染。

猪霍乱沙门菌C500运载CSFV新型基因疫苗的稳定性及免疫安全性

为研究猪霍乱沙门菌C500(S.C500)运载猪瘟病毒(CSFV)新型基因疫苗的稳定性与免疫安全性,将表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15及pCI-neo转入S.C500,采用体外增殖试验考察不同表达载体在S.C500中的稳定性;采用携质粒S.C500对ST细胞的粘附、侵袭力和增殖试验研究不同表达载体对运载体生物学特性的影响;采用BALB/c小鼠口服免疫试验研究表达质粒在体内的稳定性和运载体对小鼠的安全性。结果显示:体外增殖中pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15和pCI-ME2-IL-15稳定性好于pCI-neo,说明外源目的基因正调表达质粒在运载体内的稳定性;空运载体S.C500对ST细胞的粘附率和侵袭率均高于4组含不同质粒的菌株,而4组含不同质粒的菌株之间亦有差异;空运载菌在ST细胞内的增殖能力与4组含不同质粒的菌株之间亦有显著性差异;分别对携带表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15和pCI-ME2-IL-15菌株以每只2×108CFU/0.2 mL的剂量进行小鼠口服免疫,腹泻率依次为0%、8.33%和25%。在第7和14天,使用DHL/Amp琼脂培养平板,均可从肝脏、脾脏、十二指肠和新鲜粪便样品中分离到重组菌。试验提示采用猪霍乱沙门菌C500运载CSFV新型基因疫苗免疫BALB/c小鼠具有相对稳定性和免疫安全性。

同时检测CSFV、PRRSV的二重RT-PCR方法的建立及其在临床样品检测中的初步应用

建立了1种一步法RT-PCR用于同时检测典型猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖呼吸道综合征病毒(PRRSV)的多重PCR诊断方法(Multiplex PCR,mPCR)。根据Genbank上公布的CSFV、PRRSV基因组全序列及部分序列,借助DNAStar和Oligo6.0基因序列和引物设计软件,设计2对特异性引物分别用于扩增CFSV、PRRSV病毒777bp和434bp的目的片断。该mPCR由RT反应和PCR反应构成。将病毒核酸连接到PMD18-T载体,提取质粒后,以10倍进行倍比稀释,取每个稀释度的病毒核酸进行mPCR反应,对CSFV、PRRSV的最低检测量分别为8.5pg、8.3×10-2pg。以PCV2、PCV1、PPV、PRV、SIV、E.coil和双蒸水为模板进行mPCR反应,扩增结果均为阴性,表明该mPCR具有较好的特异性。对临床样品的检测表明,本研究建立的mPCR诊断方法能够对CSFV和PRRSV进行快速的诊断,同时对CSFV、PRRSV在猪群中的流行病学调查也具有十分重要的意义。

PRRSV+CSFV+PCV2+HPS混感病例的病理学研究

从PCR鉴定为"PRRSV+CSFV+PCV-2+HPS"混合感染的7份猪只病例中选取病变较典型脾、肺、肝以及淋巴结等组织,肉眼观察其剖检病变之后,制成病理切片,在显微镜下观察其病理变化,并将观察结果与PCR鉴定结果相对照。结果显示:"PRRSV+CSFV+PCV-2+HPS"混合感染的7份病例无论是在剖检还是在镜下都具有相似的病变并且与PCR鉴定基本相符;7份病例的病变与其他猪呼吸道疾病引起的病变有很大的共性。可见病理学研究,为我们诊断猪群疫病提供了诊断方向和必不可少的依据,但却不是唯一的依据,更多的时候还要通过临床诊断和实验室诊断。

双重RT-qPCR鉴别CSFV和BVDV方法的建立及初步应用

为建立猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的鉴别检测方法,本研究根据CSFV Npro基因、BVDV 5'-UTR基因保守区域设计特异性引物和Taq Man探针,构建阳性重组质粒,优化反应条件,建立了双重RT-q PCR检测方法。该方法 CSFV和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对206份猪病料进行检测,CSFV阳性59份、BVDV皆为阴性,与本实验室常用单项RT-q PCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重RT-q PCR整个检测过程不到3 h,采取闭管反应,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点,可用于CSFV和BVDV的临床鉴别检测,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。

同时检测CSFV、PRRSV、PRV及PCV2多重荧光定量PCR方法的建立

为建立可以同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的快速、敏感的检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的CSFV、PRRSV、PRV和PCV2 4种病毒的基因序列设计引物和探针,建立了一种能够用于同时检测这4种病毒的多重荧光定量PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果显示,4种病毒的标准曲线相关系数均达到0.98以上,具有良好的线性关系。对CSFV、PRRSV、PRV和PCV2以外的其他病毒株核酸扩增均呈阴性,具有较强的特异性。灵敏度试验结果显示,该方法对这4种病毒的最低检测量均能达到10拷贝/μL。此外,该检测方法的批内和批间重复性试验变异系数均小于5%,表明所建立的方法具有很好的重复性。利用建立的方法对59例疑似猪繁殖障碍疾病样本进行检测,结果显示,单一病毒感染样本7例,阳性率为11.86%;2种或3种病毒混合感染阳性率为44.07%(26/59);无4种病毒同时感染的样本。以上结果表明所建立的检测方法具有快速、准确、特异性好、灵敏度高等特点,能够对CSFV、PRRSV、PRV和PCV2病毒同时进行检测,可以用于相关疫情的监测及防控。

山西种猪场CSFV、PRRSV、PRV、PCV2免疫与感染情况调研

猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪圆环病毒2型感染是危害养猪业发展的四大疫病。在2013—2018年间,本课题组深入山西11个地市70多个规模化种猪场进行了猪主要疫病流行情况调查,发现种猪场普遍存在引种隔离检疫不完善、接种疫苗不科学、生物安全不到位等问题,导致这四大疫病在猪群中普遍存在;同时采集母猪公猪血样900余份,仔猪血样4000余份,病死猪组织800余份,用商业免疫学和分子学检测试剂进行了免疫抗体、感染抗体及病原核酸检测。结果显示:免疫抗体合格率:CSFV为55.89%~76.61%,PRV约为90.00%;感染抗体阳性率:PRRSV为51.11%~64.45%,PCV2为59.16%~62.06%,PRV gE为38.28%;病原核酸阳性检出率:CSFV为12.66%,PRRSV为4.38%,HP-PRRSV为22.40%,PRV为7.14%,PCV2为28.57%;同时证明以PCV2为主的混合感染严重,与其他3种病的混合感染率达到16.23%。本调研通过免疫学和分子生物学实验手段,查明了山西省种猪场CSFV、PRRSV、PRV、PCV2的免疫与感染近况,为有效防控这些疫病的流行提供科学依据。

多重实时定量PCR快速检测PRRSV、CSFV和PCV2混合感染方法的建立

根据TaqMan复合荧光探针设计原则,应用Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的特异性引物和探针,优化反应条件,建立了检测PRRSV、CSFV和PCV2的单项和多重Real-time PCR方法。结果表明,建立的方法具有高度特异性,与其他病原检测无明显交叉反应;对阳性质粒和病毒的最低检测量分别为<101个拷贝和<1TCID50/反应,检测灵敏度比常规PCR检测高100倍。通过对20份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果一致。建立的多重Real-time PCR方法可用于同时快速检测PRRSV、CSF和PCV2的混合感染,具有灵敏、特异、重复性好并能对样品进行定量检测等优点。

云南地区部分猪场猪呼吸道疾病综合症(PRDC)患病猪群中PRRSV,PCV-2,CSFV,PRV混合感染调查

针对云南省不同地区不同季节猪呼吸道疾病综合征进行流行病学调查,根据其临床特征,在不同规模养殖场共采集1 164份血清样品,利用ELISA和RT-PCR方法检测其猪瘟抗原CSFV,猪繁殖与呼吸综合征抗原PRRSV,猪伪狂犬病PRV gE抗体及猪圆环病毒2型PCV-2特异抗体。结果表明:各季节和不同生长阶段猪群存在一种及两种以上的病毒混合感染,四重感染相对较少。从全年看单独感染占39.10%,PCV-2感染率最高,其次是PRV,PRRSV和CSFV;二重感染占26.13%,以PCV-2+PRV最常见,其次是PCV-2+PRRSV、PRV+PRRSV;三重感染占8.05%,PCV-2+PRRSV+PRV最常见;有四重感染出现,仅占1.57%。从季节来看,春季和夏季混合感染最高,分别为76.53%和60.74%,冬季和秋季的混合感染率分别为59.50%和53.55%。从年龄和性别看,育肥猪的混合感染率高于仔猪,分别为68.66%和61.11%,种公猪的感染率高于母猪,分别为70.00%和55.51%。说明4种病毒有单独感染或混合感染,推测其中PCV-2在混合感染中可能充当免疫抑制的角色,混合感染使PRDC症状更明显,死亡率增高。

CSFV,SIV,PCV2,PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条件进行优化,建立了检测CSFV、SIV、PCV2、PRV和PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10pg。而对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、猪细小病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒的多重PCR的扩增结果均为阴性。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对SIV、CSFV、PCV2、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。

CSFV囊膜蛋白E2单克隆抗体识别表(拟)位基序的差异性分析

CSFV囊膜糖蛋白E2是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白.本研究应用抗CSFV(Alfort毒株)E2蛋白的单克隆抗体c2410、WH303及M1669,筛选噬菌体展示的12肽随机肽库,进行表位分析.结果发现:c2410、WH303针对同一线性表位,精确定位于E2蛋白的832～837位氨基酸SPTTLR,是CSFV特异性表位.同时发现WH303识别的2个主要拟位基序:(W)NKPxT、AxWPTA,M1669识别的3个主要拟位基序:DxMRLD、(SL)MPPF、MLLHxxPxL,但在E2蛋白中均未查找到与之相同(似)序列.应用ELISA、竞争性ELISA、免疫印迹分析不同表(拟)位对单克隆抗体的免疫反应性差异,结果发现:(1)c2410对WH303的3个噬菌体拟位(WNKPxT,AxWPxATA,SPSxLR)在ELISA、免疫印迹检测中均为阴性;(2)SPTxLR噬菌体拟位能与c2410、WH303发生特异性结合,且此结合能被病毒抗原阻断;(3)M1669的3个噬菌体拟位(DxMRLD,(SL)MPPF、MLLHxxPxL)在ELISA、免疫印迹中能与M1669发生特异性结合,但此结合不能被病毒抗原阻断.

含CSFV E2基因A/D区原核表达载体的构建、表达及其抗原性研究

应用RT PCR方法扩增了编码猪瘟病毒石门株 (CSFVshimenstrain)囊膜糖蛋白E2全基因 ,然后将其克隆到pMD 1 8T质粒中 ,获得重组质粒pMD E2。再以pMD E2为模板 ,另行设计两对引物 ,同时扩增其中一段适于在E .coli中表达且抗原反应性较好的基因片段 (E2蛋白A D抗原区基因序列 ) ,将扩增的两片段串联插入原核表达载体pET 32a中构建成重组质粒pET 2e。用酶切和序列分析鉴定插入目的基因的正确性。SDS PAGE和Western blot分析表明 ,经pET 2e转化、IPTG诱导的受体菌可表达目的蛋白 ,克隆在硫氧还蛋白 (thioredoxinprotein ,TrxA)基因下游的E2蛋白基因与TrxA基因获得了高效融合表达 ,并且具有免疫学反应活性 。

共表达PRRSVGP5蛋白和CSFV E2蛋白的“自杀性”DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

为了获得新型双价"自杀性"DNA疫苗,将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5基因克隆于此前构建的表达猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的甲病毒复制子载体疫苗pSFV1CS-E2中。为了增强免疫效果,在密码子优化的GP5基因中插入了泛DR表位(PADRE),在CSFV E2基因后融合伪狂犬病病毒(PrV)UL49基因,获得了6种重组质粒。间接免疫荧光试验显示,PRRSV GP5和CSFV E2基因在瞬时转染的293T细胞中得到同时表达。将6种重组质粒和空载体pSFV1CS分别免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测血清抗体水平,通过基于CSFE/WST-8的淋巴细胞增殖试验和细胞因子ELISA评价疫苗诱导的细胞免疫。结果显示,除pSFV1CS组外,从各疫苗组小鼠血清中均可检测到低水平的针对GP5和E2蛋白的抗体;各疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后均能诱导特异性的淋巴细胞增殖;部分疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4;引入UL49的疫苗组细胞免疫应答显著高于其它疫苗组。结果表明,这些共表达GP5和E2蛋白的自杀性DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫,PrV UL49可以增强其细胞免疫应答。

冀鲁豫交界地区PCV-2和CSFV血清抗体调查

调查了冀鲁豫三省交界地区规模养殖场猪群圆环病毒2型（PCV-2）抗体阳性率与其他地区的差异和流行病学特点、PCV-2抗体阳性率对猪瘟病毒（CSFV）抗体的影响。在该地区选择了7个猪场采集了222份血清，用ELISA试剂盒检测PCV-2型和CSFV的抗体水平并进行统计学分析。检测结果表明，7个养猪场的猪群都感染过PCV-2，发生疑似感染的猪病例中PCV-2的平均抗体阳性率在62．29／6～72．0％之间，高于其他地区。而猪瘟免疫合格率仅有32．4％～42．4％。PCV-2抗体水平高的猪，猪瘟抗体水平低。表明该地区PCV-2的感染情况比较严重。