山羊CSN2基因内含子7靶向的CRISPR-Cas9系统高效切割位点筛选

【目的】使用CRISPR-Cas9系统在山羊CSN2基因座内含子7上筛选出高效的切割位点.【方法】根据"20N+NGG"原则在CSN2内含子7序列中设计了5个sgRNA靶向位点.分别连接具有sgRNA到和Cas9表达框的PX330-P2A-eGFP载体上,通过脂质体转染到实验室保存山羊胎儿成纤维细胞系中,PCR扩增转染阳性的细胞基因组CSN2内含子7序列,连接到Pmd19-T载体中,测序比较不同的sgRNA介导切割产生的突变.【结果】使用5个sgRNA均可以在山羊CSN2基因内含子7上造成有效切割,产生碱基删除或者插入突变.实验设计的5个sgRNA介导的CRISPR-Cas9系统效率均在30.7%以上,效率最高的2号位点(sgRNA2)介导的切割效率达到了61.5%.【结论】研究确定了CRISPR-Cas9系统在山羊CSN2基因内含子7内进行高效切割的sgRNA,为之后在该基因位点进行高效的非同源介导基因敲入奠定了基础.

山羊β-酪蛋白基因调控区的克隆及启动子活性的检测

为了克隆山羊β-酪蛋白基因的调控区并检测5′调控区的启动子活性,利用Long PCR技术对西农莎能奶山羊β-酪蛋白基因(CSN2)5′和3′调控区进行了克隆(5′调控区分两段进行克隆,3′调控区进行直接克隆)、测序,将克隆的5′调控区的两个片段通过共有的单一性酶切位点HindⅢ融合成一个长为6.7 kb的片段,用其替代表达载体pEGFP-C1上原来的启动子CMV,指导报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在山羊乳腺上皮细胞中的瞬时表达。结果表明,克隆的GC 3.3、GC 4.3、GC 6.6 3个片段与GenBank中登录的山羊CSN2基因相应序列相比,同源性均为99%,其包含了TATA box、GC island、CAAT box、SAR、AP1、Oct-1、Sm、Glyco、Pu-1、CAC等复合元件和转录翻译调节因子的作用位点,并且5′调控区可以有效指导报告基因的表达,从而初步验证了所克隆的山羊CSN2基因5′调控区的有效性,表明克隆的调控区可用于乳腺生物反应器的研究。

基于CRISPR/Cas9系统构建重组人丁酰胆碱酯酶定向整合的山羊胎儿成纤维细胞株

目的 利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复机制构建重组人丁酰胆碱酯酶(rhBChE)基因敲入山羊胎儿成纤维细胞株(GFF),为后续制备表达rhBChE的山羊提供细胞株。方法 针对山羊β-酪蛋白(CSN2)基因设计并筛选有效sgRNA靶点,通过电转染、流式分选和PCR产物测序,在山羊乳腺上皮细胞(GMEC)中确认CSN2基因有效sgRNA;构建靶向有效靶点的红色荧光报告基因同源修复载体(P2A-mCherry),利用流式细胞术检测该靶点的定向整合及表达效率;构建靶向山羊胎儿成纤维细胞CSN2基因有效靶点的rhBChE同源修复载体(P2A-rhBChE),通过电转染和流式分选rhBChE阳性细胞克隆,经PCR产物测序鉴定rhBChE定向整合的阳性细胞株。结果 确定sgRNA4为山羊CSN2基因的有效靶点,该靶点可用于目的基因的定向整合;成功构建3株rhBChE定向整合的阳性细胞株。结论 靶向山羊CSN2基因的rhBChE阳性细胞株可为应用体细胞克隆技术制备乳腺表达rhBChE的山羊奠定基础。