基于IL-6/STAT3信号通路探讨山楂酸对小鼠结肠癌CT26细胞增殖、凋亡的影响

目的从IL-6/STAT3信号通路探讨山楂酸(MA)对小鼠结肠癌CT26细胞增殖、凋亡的影响。方法体外培养CT26细胞,设置空白组、10、20、30、35、40μmoL·L^(-1)MA组。干预24 h后,采用CCK-8法检测山楂酸对细胞活力的影响,采用RT-PCR检测IL-6 mRNA表达水平,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,采用Western blotting检测各组细胞中STAT3通路相关蛋白的表达水平。设置空白组、IL-6(20 ng·μL^(-1))刺激组、不同浓度MA与IL-6共刺激组,采用Western blotting检测各组细胞p-STAT3、STAT3蛋白的表达水平。设置空白组、MA组、磷酸酶抑制剂(正钒酸钠)组和MA+正钒酸钠组,采用Western blotting检测各组细胞p-STAT3、STAT3蛋白的表达水平。结果与空白组相比,CCK-8结果显示20、30、35、40、45、50μmoL·L^(-1)浓度的山楂酸均能降低CT26细胞活力(P<0.05),IC50=37.32μmoL·L^(-1);RT-PCR结果显示30、35、40μmoL·L^(-1)给药组细胞中IL-6 mRNA水平下降(P<0.05);流式细胞术结果显示30、35、40μmoL·L^(-1)给药组细胞凋亡率增加(P<0.05);Western blotting结果显示35、40μmoL·L^(-1)给药组细胞中STAT3通路相关蛋白p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平下降(P<0.05),MA+正钒酸钠组能恢复MA单独给药组中被降低的p-STAT3蛋白水平(P<0.05)。结论MA可能通过降低IL-6的表达水平,抑制STAT3的磷酸化,从而降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进肿瘤细胞凋亡,抑制其增殖。

小檗碱对CT26皮下移植瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞的影响

目的观察小檗碱的抑瘤作用及其对肿瘤组织内肿瘤相关巨噬细胞数量的影响。方法 BABL/c小鼠40只随机分2组,全部皮下移植结肠癌细胞(CT26细胞系),次日进行药物干预。治疗组小鼠腹腔注射小檗碱,100mmol/L,200μl/d,14d;对照组腹腔注射等量生理盐水。肿瘤细胞接种7d后连续动态测定肿瘤体积,接种15d处死全部动物,取肿瘤组织、免疫组织化学显色检测肿瘤组织中M2型巨噬细胞标志物CD206及CD68的表达。结果小鼠皮下移植CT26后,小檗碱治疗组小鼠皮下移植瘤生长缓慢。与对照组比较,肿瘤体积及瘤重均显著减少(P<0.05);皮下移植15d肿瘤组织中可见大量CD206及CD68阳性细胞;肿瘤组织中CD206及CD68阳性细胞数量显著减少(P<0.05 orP<0.01)。结论小檗碱可能通过抑制肿瘤相关巨噬细胞的形成而发挥抗肿瘤作用。

刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌细胞ct26体外增殖和细胞周期的影响

目的研究刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌ct26细胞体外增殖和细胞周期的影响,并探讨其作用的分子机制。方法取对数生长期的小鼠结肠癌ct26细胞,建立弓形虫与ct26复合感染度(moi)分别为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1的共培养试验模型,台盼兰排斥试验连续7d绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测8∶1共培养模型组6h、12h、24h、48h细胞周期改变;采用半定量RT-PCR方法分别检测ct26细胞cyclinB1、cdc2基因转录水平变化;Westernblot方法检测细胞周期蛋白cyclinB1蛋白水平变化。结果台盼兰排斥试验发现各比例组弓形虫均能有效抑制小鼠ct26细胞的体外增殖,且呈现前4d缓慢抑制,4d后细胞大量死亡的现象,以8∶1模型组的增殖抑制作用最明显,感染7d后细胞抑制率达80.77%(P<0.01);流式细胞仪检测发现8∶1模型组弓形虫可在各作用时间明显改变ct26细胞周期分布,使G0/G1期细胞百分比下降,G2/M期百分比显著升高(P<0.01),24h达到作用高峰,使G2/M期百分比升高12.77%,48h则细胞G2/M期百分比下降;弓形虫感染ct26细胞3～24h,细胞cdc2转录水平在各个时间点未见明显变化,细胞cyclinB1从转录水平和蛋白水平均呈现为感染3h时表达增强,随后各时间点均明显降低的现象,cyclinB1基因转录水平在感染后24h只达到对照组的16.55%。结论弓形虫RH株速殖子可明显抑制小鼠结肠癌ct26细胞体外增殖,感染前期以诱导细胞发生G2/M期阻滞为主要机制,细胞周期蛋白cyclinB1活性下降在G2/M期阻滞中起主要作用。

大黄素对CT26结肠癌小鼠调节性T细胞功能的影响

目的:探讨大黄素对CT26结肠癌小鼠调节性T细胞免疫抑制功能的影响。方法:CT26结肠癌小鼠分为阴性对照组、大黄素治疗组和荷瘤模型组,给药14 d,分别检测以下指标:小鼠不同组织T细胞IFN-γ的分泌、效应细胞CD8+CD3+T细胞的比例、血清细胞因子IFN-γ、TNF-β1、IL-10的水平、不同组织CD4+CD25+Tregs IL-10的分泌。结果:大黄素明显升高CD8+CD3+T细胞在肿瘤局部的比例(P<0.05);大黄素显著提高外周血和淋巴结中T细胞分泌IFN-γ的能力(P<0.05);大黄素显著降低IFN-γ、TNF-β1、IL-10在血清中的水平(P<0.01);大黄素有抑制CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的作用(P<0.01)。结论:大黄素可能通过影响Tregs的免疫抑制功能发挥抗肿瘤的作用。

复方藤梨根制剂对小鼠CT26移植瘤生长及对MVD影响的研究

目的:通过建立Balb/c小鼠CT26人工种植模型,研究复方藤梨根制剂对肿瘤抑制效果及对MVD表达的影响。方法:①100只7周龄雌雄各半Balb/c小鼠随机分为5组,即空白对照组、荷瘤对照组、低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组。各组分别皮下接种造模。②造模后第2 d开始连续灌胃3周。给药组予低浓度0.5 g/mL、中浓度1 g/mL、高浓度2 g/mL复方藤梨根制剂灌胃,空白对照组、荷瘤对照组每天以生理盐水灌胃。③所有小鼠第22 d处死,观察各组的瘤重、抑瘤率,免疫组化检测各组小鼠肿瘤CD34标记的MVD。结果:FFTLG低、中、高剂量组抑瘤率分别为-7.05%、23.03%、32.91%;中、高剂量给药组的瘤重与低剂量组和荷瘤组有明显差异(P<0.05),中、高剂量给药组的MVD对比荷瘤对照组有显著性差异(P<0.05)。结论:复方藤梨根制剂能抑制肿瘤生长,减少CT26瘤体中MVD,具有抗肿瘤血管生成作用。

刚地弓形虫RH株速殖子协同VP-16体外杀伤小鼠结肠癌细胞ct26的作用

目的探讨刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌ct26细胞周期的影响及其协同细胞周期特异性抗癌药依托泊甙(VP-16)对ct26细胞的杀伤作用。方法建立弓形虫RH株速殖子与小鼠结肠癌ct26细胞不同比例的共培养模型(虫/细胞比例分别为2:1、4:1、8:1、16:1),流式细胞仪检测24h细胞周期改变;以虫细胞比例2:1预先感染ct26细胞24h,CCK-8比色法观察不同浓度VP-16对细胞增殖抑制的改变;荧光显微镜观察VP-16(40μg/mL)对感染虫体细胞的形态学改变。台盼蓝染色观察不同浓度VP-16分别作用弓形虫RH株速殖子悬液(1×106/mL)2h、4h、12h、24h的虫体存活度改变。琼脂糖凝胶电泳观察VP-16(20μg/mL)对虫体DNA影响。结果流式细胞仪检测发现各浓度弓形虫速殖子均可明显改变ct26细胞24h周期分布,使G0/G1期细胞百分比下降,G2/M期百分比显著升高(P<0.01)。2×106个速殖子感染细胞24h可使S期和G2期细胞百分比共同增长14.92%。CCK-8比色法检测结果显示虫细胞比例2:1预先感染ct26细胞24h可有效增强各浓度VP-16对ct26细胞的杀伤作用;Hochest33258染色结合荧光显微镜观察到虫体胞质寄生形态及VP-16诱导感染细胞凋亡典型形态;10μg/mL及更高浓度VP-16作用弓形虫4h以上均可使虫体全部死亡;琼脂糖凝胶电泳发现VP-16(20μg/mL)可使弓形虫速殖子DNA呈现典型的云梯状条带。结论弓形虫RH株速殖子可使小鼠结肠癌ct26细胞发生G2/M期,可有效增强细胞周期特异性抗癌药VP-16的抗癌作用,且弓形虫增殖亦明显受抑并发生凋亡。

消癌解毒方对CT26荷瘤小鼠抗结肠癌药效及机制研究

目的：观察消癌解毒方对小鼠CT26结肠癌细胞皮下移植瘤的抑制作用及其作用机制。方法：将以插块法接种结肠癌细胞皮下移植瘤成功的CT26荷瘤小鼠随机分为模型组（Veh）、阳性药物奥沙利铂组（OXA）、和消癌解毒方组（XJD）,观察各组小鼠体质量、肿瘤体积、肿瘤质量、计算抑瘤率。采用Western-Blot、免疫组化法检测肿瘤组织样品中F4/80,TGF-β1,IL-6和IL-1β的表达,并与模型组和奥沙利铂组进行比较,研究消癌解毒方对结肠癌细胞皮下移植瘤的抑制作用及其作用机制。结果：消癌解毒方能够比较明显地抑制瘤体生长,改善结肠癌小鼠生存质量,该组小鼠肿瘤组织中F4/80,TGF-β1,IL-6和IL-1β表达量均高于模型组（P〈0.01,P〈0.05）。结论：消癌解毒方能够通过增强肿瘤部位巨噬细胞的活性,增加细胞因子IL-1β,IL-6的表达;同时增加荷瘤小鼠肿瘤部位TGF-β1的表达来达到杀伤和诱导肿瘤细胞的凋亡,两种途径提高机体对肿瘤的免疫抑制,来延缓结肠癌的发生发展。

RPS20 miRNA质粒载体的CT26细胞转染条件优化研究

目的探讨阳离子脂质体法转染CT26细胞适宜的转染条件,为小鼠体内以RNA干扰法进行脾虚证相关基因RPS20的功能鉴定提供参考。方法以6孔培养板培养CT26细胞,利用阳离子脂质体转染pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-neg Control plasmid进入CT26细胞,荧光显微镜、流式细胞仪两种方式观察不同剂量的质粒和转染试剂对转染效率的影响。结果荧光显微镜下细胞计数法检测转染效率,4.0μg和6.0μg质粒的转染效率无明显差异;流式细胞仪检测转染效率,以Lipofectamine2000 15.0μL+质粒4μg转染效率最高,平均为25.3%。结论 6孔培养板,4.0μg质粒+15.0 μL Lipofectamine2000为CT26细胞优化的转染条件。

白及多糖通过调节免疫作用抑制结肠癌CT26荷瘤小鼠肿瘤生长

目的:研究白及多糖(BSP)对结肠癌CT26荷瘤小鼠的抗肿瘤及免疫调节作用。方法:从30只BALB/c小鼠中随机选取6只作为对照组(Control),剩余24只小鼠右前肢皮下接种CT26细胞构建CT26结肠癌小鼠模型,建模成功后将模型裸鼠分为荷瘤模型组(Model)、白及多糖低剂量组[BSP-L,100 mg/(kg·d)]、白及多糖高剂量组[BSP-H,400 mg/(kg·d)]和阳性药物香菇多糖组[LNT,150 mg/(kg·d)],每组6只。所有小鼠连续灌胃给药3周,其中对照组和模型组每天给予与药物组等量生理盐水灌胃。比较各组肿瘤体积、肿瘤抑制率及免疫器官指数。MTT法检测脾脏淋巴细胞增殖活性,ELISA法检测血清免疫因子IL-2和IFN-γ水平;流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群;Western blot检测各组小鼠脾脏组织中TLR4、My D88、NF-κB p65蛋白表达水平。结果:与Model组相比,BSP-H组和LNT组移植瘤体积显著缩小,肿瘤重量显著降低,抑瘤率显著增加(P<0.01)。与Control组相比,Model组小鼠脾脏指数、胸腺指数、脾脏淋巴细胞活性、血清中免疫因子IL-2和IFN-γ水平、外周血CD4^(+)/CD8^(+)及脾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与Model组相比,BSP-H组小鼠脾脏指数、胸腺指数、脾脏淋巴细胞活性、血清中免疫因子IL-2和IFN-γ水平、外周血CD4^(+)/CD8^(+)及脾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显著上升(P<0.05);而BSP-L组与Model组相比,以上各指标变化均无显著性差异(P>0.05)。结论:白及多糖对结肠癌CT26荷瘤小鼠肿瘤生长有抑制作用,可能与增强荷瘤小鼠抗肿瘤免疫、激活TLR4/NF-κB信号通路有关。

大黄素对小鼠结肠癌CT26.WT细胞的抑制作用

目的探讨大黄素对小鼠结肠癌细胞CT26.WT的抑制作用。方法 MTT法检测大黄素对结肠癌细胞CT26.WT增殖的抑制作用;细胞划痕实验检测大黄素对结肠癌细胞CT26.WT迁徙的抑制作用;流式细胞仪检测大黄素对结肠癌细胞CT26.WT表达CC族趋化因子受体4(CCR4)和叉头蛋白3(Foxp3)的影响。结果大黄素明显抑制CT26.WT细胞的增殖,加入的大黄素浓度越高抑制效果越好(P<0.05);大黄素抑制CT26.WT细胞的迁徙,抑制效果随浓度升高而愈加明显(P<0.01);大黄素抑制CT26.WT细胞的Foxp3表达,而表达CCR4的肿瘤细胞的比例同样低于不加药组,这种抑制作用与大黄素的药物浓度呈负相关(P<0.01)。结论大黄素抑制小鼠结肠癌的CT26.WT细胞增殖,Foxp3和CCR4在CT26.WT细胞的表达降低,可能是大黄素抑制其迁徙的原故。

大黄[庶虫]虫丸抑制趋化因子配体17表达对CT26小鼠结肠癌的影响

目的观察大黄[庶虫]虫丸对趋化因子配体17(CCL17)在CT26结肠癌小鼠模型中表达的影响,研究其可能的抗肿瘤作用机制。方法复制CT26结肠癌小鼠模型,将模型小鼠随机分为模型组,大黄[庶虫]虫丸高、中、低剂量组(48、24、12 g·kg^-1·d-1),另设正常组。计算各组小鼠结肠癌的抑瘤率;用流式细胞术和免疫荧光法分别检测外周血、肿瘤归巢淋巴结和肿瘤组织细胞中调节性T细胞(Tregs)百分比,肿瘤组织中CCL17的表达,趋化因子受体4(CCR4)在外周血和肿瘤组织细胞表面的表达百分比和肿瘤组织细胞核转录因子κB(NF-κB)p65的表达。结果大黄[庶虫]虫丸能明显抑制小鼠结肠癌的生长,且呈剂量依赖性;大黄[庶虫]虫丸各剂量组肿瘤组织中Tregs明显减少(P<0.05),肿瘤组织中CCL17的荧光强度明显下降(P<0.05);模型组的CCR4+Tregs百分比和CCL17荧光强度最高,大黄[庶虫]虫丸各剂量组随着用药浓度增加,CCR4+Tregs百分比和CCL17荧光强度均表现为依次降低(P<0.05);大黄[庶虫]虫丸能显著抑制结肠癌细胞NF-κB的活化(P<0.05),NF-κB p65的荧光比例显著降低。结论大黄[庶虫]虫丸可通过减少肿瘤组织中Tregs的聚集,降低肿瘤组织中CCL17的表达,下调CCR4在Treg细胞表面的表达比率,降低结肠癌细胞NF-κB p65在细胞内的表达,从而抑制CT26小鼠结肠癌细胞的生长。

EMMPRIN基因增强CT26小鼠结肠癌细胞的转移潜能

背景与目的:结肠癌的侵袭转移是临床上绝大多数结肠癌患者的致死因素,研究表明,细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)基因参与了肿瘤的转移过程。为研究EMMPRIN基因在结肠癌侵袭转移过程中的意义,本研究将初步探讨EMMPRIN基因对CT26小鼠结肠癌细胞转移潜能的影响。方法:构建包含EMMPRIN基因编码框的真核表达载体pCMV-HA2-EMMPRIN,通过质脂体转染CT26细胞,经G418筛选,建立稳定表达EMMPRIN基因的CT26细胞株。通过体外侵袭实验、迁移实验、粘附实验分析EMMPRIN在CT26中过表达及CT26细胞在侵袭、迁移、粘附等转移能力上的改变。结果:当EMMPRIN基因在CT26细胞稳定过表达后,侵袭实验的结果为EMMPRIN组:103.33±8.49个细胞,对照组:48.67±5.31个细胞(P<0.01);迁移实验的结果为EMMPRIN组:40.67±2.49个细胞,对照组:18.33±2.05个细胞(P<0.01);粘附实验的CCK-8检测结果为EMMPRIN组:2.10±0.22,对照组:3.33±0.17(P<0.01)。结论:EMMPRIN基因可明显促进小鼠结肠癌细胞CT26的侵袭与迁移,并抑制其粘附,提示EMMPRIN基因对CT26细胞的转移具有促进作用。

凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠T淋巴细胞增殖及活性的影响

目的探讨凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠T淋巴细胞增殖及活性的影响。方法 (1)取对数生长期大肠癌CT26细胞制备凋亡肿瘤细胞及坏死肿瘤细胞,取Balb/c小鼠脾脏分离T淋巴细胞,并制备细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。(2)将凋亡肿瘤细胞、坏死肿瘤细胞、正常肿瘤细胞分别与小鼠CTL共同培养(分别为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组),测定CTL的活性及增殖情况。(3)将小鼠T淋巴细胞分为对照组、刀豆蛋白A(Con A)组、凋亡肿瘤细胞+Con A组、坏死肿瘤细胞+Con A组、活肿瘤细胞+Con A组,经相应处理后测定各组T淋巴细胞的活性及增殖情况。(4)选取30只Balb/c小鼠分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组各10只,分别将凋亡、坏死、对数生长期CT26细胞通过皮下及静脉输注小鼠,检测各组小鼠血清调节性T细胞(Treg)的表达情况。(5)另取30只小鼠,按方法(4)分组及处理后,测定各组小鼠血清可溶性Fas(s Fas)、白细胞介素(IL)-12、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-4、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平。结果凋亡肿瘤细胞组中CTL的活性、A450值均低于其他两组(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞+Con A组的T淋巴细胞CD69、CD25、CD71的表达率以及G2、G3及G4期的T淋巴细胞数量均低于Con A组、活肿瘤细胞+Con A及坏死肿瘤细胞+Con A(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞组Treg的表达水平、s Fas相对表达量低于肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞组IL-10、TGF-β表达水平高于其他两组(P<0.05),而IL-12表达水平均低于其他两组(P<0.05),IL-4表达水平则高于肿瘤细胞对照组(P<0.05)。结论凋亡小鼠大肠癌CT26细胞能够抑制小鼠T淋巴细胞增殖及活性,影响大肠癌小鼠正常免疫功能。

凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠血清免疫因子水平以及免疫细胞增殖、活性的影响

目的探讨凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠血清免疫因子水平以及免疫细胞增殖、活性的影响。方法取对数生长期大肠癌CT26细胞制备凋亡、坏死肿瘤细胞。取Balb/c小鼠20只,分离T淋巴细胞亚群及自然杀伤(NK)细胞、获取巨噬细胞,并制备细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。将小鼠CTL、NK细胞、巨噬细胞分别经相应肿瘤细胞处理后,均分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组,应用51Cr释放实验测定各组CTL、NK细胞、巨噬细胞的活性,细胞计数(CCK-8)法检测各组CTL、NK细胞和巨噬细胞的增殖情况。另选取Balb/c小鼠分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组各10只,分别将凋亡、坏死、对数生长期CT26细胞按通过皮下及静脉输注小鼠,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠血清可溶性Fas(s Fas)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-4、IL-10、IL-12、转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平。结果与坏死肿瘤细胞组及肿瘤细胞对照组比较,凋亡肿瘤细胞组中不同效靶比的CTL、NK细胞及巨噬细胞活性均降低(P<0.05)。CCK-8法检测结果显示,凋亡肿瘤细胞组的CTL、NK细胞及巨噬细胞的A450值均低于坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组(P<0.05)。ELISA检测显示凋亡肿瘤细胞组s Fas相对表达量低于坏死肿瘤细胞组和肿瘤细胞对照组(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞组IL-4表达水平高于肿瘤细胞对照组(P<0.05),IL-10、TGF-β表达水平则高于其他两组(P<0.05),IL-12表达水平低于其他两组(P<0.05)。结论凋亡大肠癌CT26细胞能够抑制小鼠特异性CTL、NK细胞、巨噬细胞增殖及其活性,影响大肠癌小鼠正常免疫功能。

高压氧对小鼠CT26结肠腺癌细胞周期和荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

目的探讨高压氧(HBO)对小鼠CT26结肠癌细胞周期和荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。方法应用流式细胞仪检测对照组和HBO组CT26癌细胞的细胞周期;建立小鼠结肠癌移植瘤模型,观察0.2MPaHBO对CT26癌细胞移植瘤生长的影响。结果对照组细胞在G0G1期、S期、G2M期的比例分别为74.82%、20.38%、4.80%;而HBO后12h组为66.48%、33.16%、0.36%,HBO后24h组为55.89%、40.79%、3.32%。HBO组小鼠肿瘤的体积和重量较模型对照组降低,肿瘤体积抑制率为32.39%,重量抑制率为35.77%。结论HBO可使CT26细胞在S期积蓄,并抑制荷瘤小鼠移植瘤的生长。

cRGD修饰负载锌的枝状介孔硅载体递送双硫仑靶向杀伤结直肠癌CT26细胞

目的:制备一种精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽(cRGD)修饰、Zn^(2+)掺杂并负载双硫仑(DSF)的树枝状介孔硅纳米颗粒,初步研究其对结直肠癌CT26细胞的靶向杀伤作用。方法:采用水热合成法将Zn^(2+)锚定在树枝状介孔硅纳米颗粒的骨架中,再将DSF负载在介孔孔道中,偶联靶向配体cRGD到纳米颗粒的表面,得到具有靶向功能的纳米颗粒DSF@Zn-DMSN-cRGD。采用透射电镜(TEM)检测DSF@Zn-DMSN-cRGD的表面形貌,通过能谱面扫得到元素映射图验证其中的元素分布,通过激光粒度仪检测其粒径与电位变化,使用红外光谱仪检测表面主要化学键。通过TEM观察载体Zn-DMSN在pH6.5和pH7.4的模拟体液中共培养后的形态,采用细胞摄取实验检测cRGD修饰的Zn-DMSN靶向CT26细胞的能力,采用CCK-8法、Calcein-AM/PI染色法和流式细胞术检测DSF@Zn-DMSN-cRGD对CT26细胞的杀伤能力及对细胞凋亡的影响。结果:TEM观察表明DSF@ZnDMSN-cRGD表面具有多孔径,元素映射结果显示Zn元素和DSF成功负载在纳米颗粒表面,红外光谱仪检测结果表明cRGD成功偶联在DSF@Zn-DMSN介孔硅复合载体的表面,电位粒径结果显示粒径较未偶联cRGD前稍大,电位明显增加(P<0.000 1),TEM观察发现Zn-DMSN在微酸性环境中其骨架崩解明显增多,细胞摄取实验结果表明经cRGD修饰后的Zn-DMSN被CT26细胞内吞的效率显著增加(P<0.05)。CCK-8法、Calcein-AM/PI染色法和流式细胞术检测结果说明DSF@Zn-DMSN-cRGD能够高效杀伤CT26细胞(均P<0.000 1)并诱导细胞发生凋亡(均P<0.000 1),而对正常地肠上皮细胞NCM460无明显损伤。结论:成功合成了一种掺杂锌、负载DSF并偶联cRGD的纳米颗粒DSF@Zn-DMSN-cRGD,其载体Zn-DMSN骨架具有良好的pH降解性,其中的c RGD能促进纳米颗粒被CT26细胞靶向内吞;在体外实验中,Zn-DMSN-cRGD能够对结直肠癌CT26细胞产生强烈的靶向细胞毒性。

芬戈莫德对CT26结肠癌细胞表达Foxp3的影响

目的探讨芬戈莫德(FTY720)抑制小鼠结肠癌发展及影响CT26细胞Foxp3表达的机制。方法体内体外检测CT26细胞Foxp3表达率,ELISA检测小鼠血清的转化生长因子-β1(TGF-β1)的水平,流式细胞仪检测小鼠外周血、肿瘤回流淋巴结和肿瘤组织Foxp3+调节性T细胞(Tregs)的比例,计算抑瘤率,观察不同浓度FTY720对上述指标的影响。结果 FTY720明显抑制肿瘤生长,抑制CT26细胞Foxp3的表达,降低血清TGF-β1的水平,且剂量越大抑制效果越好(P<0.05);降低结肠癌小鼠外周血、肿瘤回流淋巴结,尤其是肿瘤组织Foxp3+Tregs的比例(P<0.05)。结论 FTY720抑制小鼠结肠癌的发展与肿瘤局部Foxp3+Tregs减少相关,而CT26结肠癌细胞Foxp3表达下调可能是FTY720抑制Tregs的重要原因。

RPS20 RNA干扰慢病毒的构建及其对CT26细胞生长的影响

目的研究脾虚证差异表达基因——核糖体蛋白S20(RPS20)RNA干扰慢病毒转染对小鼠结肠癌细胞(CT26)细胞指数的影响,验证前期筛选的RNA干扰序列的有效性,为后续在小鼠体内以RNA干扰进行RPS20的功能鉴定提供参考。方法根据前期筛选的RPS20 RNA干扰有效序列,进行质粒载体的重组,包装RPS20干扰慢病毒并转染CT26细胞,采用xCELLigence细胞动态分析仪实时监测转染后细胞的细胞指数以反映细胞的生长情况。结果测序图谱和Blast比对结果表明重组慢病毒包装载体构建成功,慢病毒滴度为1.2×105TU/mL,RNA干扰慢病毒转染后CT26细胞指数的增长受到明显抑制,转染后30 h细胞指数抑制率达到82.24%。结论前期筛选的RPS20 RNA干扰序列可成功构建包装干扰慢病毒,转染后能有效抑制CT26细胞的生长,可为后续研究提供参考。

hMIP-1β基因转染小鼠结肠腺癌CT26细胞对免疫细胞的体内外趋化作用

探讨转染人巨噬细胞炎性蛋白1β(human macrophage inflammatory protein-1 beta,hMIP-1β)基因的小鼠结肠腺癌CT26细胞的生物学特性、致瘤性及对免疫细胞的体内外趋化作用。利用重组腺病毒载体携带hMIP-1β基因(AdhMIP-1β)转染CT26细胞。X-gal染色法检测基因转染效率;ELISA法检测基因转染CT26细胞培养上清中hMIP-1β的含量;Boyden趋化小室法检测培养上清对CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)的趋化作用。小鼠皮下接种转染hMIP-1β基因的CT26细胞,观察其体内致瘤性和对免疫细胞的趋化作用。结果显示,腺病毒载体可携带hMIP-1β基因转染CT26细胞并高效表达hMIP-1β(P<0.01),培养上清含hMIP-1β且对免疫细胞有明显趋化作用。转染hMIP-1β基因的CT26细胞皮下接种后成瘤率降低,肿瘤生长速度减慢,肿瘤内可见明显坏死灶,坏死灶内和周围可见较多淋巴细胞浸润。提示hMIP-1β基因转染CT26细胞后,通过分泌hMIP-1β趋化淋巴细胞等免疫细胞到肿瘤局部发挥有效的抗肿瘤作用,从而为肿瘤的免疫治疗提供新的思路和策略。

ART1基因的表达对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能作用机制

目的探讨ART1基因的表达对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能作用机制。方法将ART1-sh RNA转入到小鼠结肠癌CT26细胞,置于荧光显微镜下观察该病毒的转染效率;采用RT-PCR和Western印迹法鉴定ART1基因沉默的效果;采用侵袭实验及黏附实验观察CT26细胞受ART1基因沉默的影响,并采用明胶酶谱法测定对该细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白活性的影响。结果病毒感染4 d后ART1 m RNA的表达量在ART1-sh RNA组中明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。ART1-sh RNA组CT26细胞的ART1蛋白的表达量明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。ART1-sh RNA组CT26细胞数明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);ART1-sh RNA组的侵袭抑制率与阴性对照组和空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照组和空白对照组相比,RT1-sh RNA组CT26细胞与纤维连接蛋白的黏附能力均明显降低(P<0.01)。RT1-sh RNA组CT26细胞中Rho A/Rho相关螺旋卷曲形成蛋白激酶(ROCK1)、Rho A、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。结论 ART1基因沉默能够导致小鼠结肠癌CT26细胞的侵袭和黏附力降低,可能与ART1基因沉默后ROCK1、Rho A、MMP-2、MMP-9的表达水平下调有关。说明ART1基因在结肠癌的侵袭和转移中具有重要作用。