IL-17D调控CD93^(+)CTL在肺脏肿瘤微环境中的杀伤功能及桔梗的促进作用

目的:探讨IL-17D调控CD93^(+)CTL在肺脏肿瘤微环境(TME)中的杀伤功能及桔梗(PG)的促进作用。方法:采用PG或IL-17D处理小鼠肺脏B16黑色素瘤模型和对照小鼠,观察肺脏肿瘤克隆形成;应用单细胞测序、免疫荧光染色、流式细胞术等方法检测肿瘤小鼠肺脏IL-17D表达变化;采用单细胞测序、流式细胞术等方法分别检测各组小鼠肺脏CD93^(+)CTL含量、细胞表型和功能因子改变(包括CD107a、穿孔素、颗粒酶B、趋化因子CCL2、CXCL9及趋化因子受体CCR2、CXCR3等);利用EL4细胞系,采用Western blot、RT-PCR检测桔梗皂苷D对IL-17D及其转录调控因子NRF2表达的作用。结果:小鼠肺脏CD93^(+)CTL较CD93−CTL高表达穿孔素、CD107a等细胞毒性效应因子和趋化因子受体CXCR3、CCR2等,而颗粒酶B分泌能力无显著差异;小鼠肺脏肿瘤模型中,肺脏IL-17D表达及其CD93^(+)CTL含量明显下降(P<0.001);肿瘤小鼠经IL-17D回补实验,或经PG处理10 d后,肺脏IL-17D和CD93^(+)CTL比例和数量明显增多(P<0.05),肿瘤克隆明显减少。同时,肿瘤局部CD93^(+)CTL募集和功能相关细胞因子CCL2、CXCL9、IL-17D等表达明显上调。PG对IL-17D的上调作用在EL4细胞系体外实验中也得到了验证,桔梗皂苷D可显著上调EL4细胞IL-17D及其转录调控因子NRF2表达。结论:中药PG及其提取物可上调肺脏IL-17D表达,增强肺脏CD93^(+)CTL浸润和杀伤功能,拮抗肿瘤在肺脏的恶性进展,是PG改善肺脏TME的重要药理机制。

猪圆环病毒2型全基因组序列分析及Cap蛋白CTL表位预测

【目的】监测当前湖南省猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株及其衣壳蛋白(capsid protein,Cap)变异情况,并预测Cap蛋白细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位,为新型PCV2疫苗研制和病毒净化提供参考依据。【方法】本研究对2019-2021年于湖南省6个地区收集的17份PCV2阳性组织样品进行PCV2全基因组序列扩增及测序分析,绘制系统进化树,利用生物信息学方法分析Cap蛋白氨基酸变异情况,并预测CTL表位。【结果】系统进化树显示,获得的17株PCV2全基因组序列中,1株PCV2a、7株PCV2b和9株PCV2d。Cap蛋白氨基酸序列比对分析发现,共有16个氨基酸残基突变位点位于病毒Cap蛋白表面,且有11个突变位点参与构象型表位的形成。此外,共预测出9个PCV2 Cap蛋白潜在的CTL表位,其中4个表位(16-24、28-36、136-144和179-187位氨基酸)在GenBank的1610株PCV2不同基因型毒株中高度保守。通过TCR-pMHC复合物3D结构对4个保守性表位进一步分析,结果显示,这4个肽段均能与MHCⅠ分子和TCR形成稳定的TCR-pMHC复合物。【结论】本研究结果表明,PCV2b和PCV2d为当前湖南省主要流行的基因型,且表现出高度变异;预测的CTL表位可作为候选抗原表位。

肺癌gp96-多肽复合物/DC疫苗体外诱导CTL反应的实验研究

目的 研究热休克蛋白gp96 多肽复合物负载树突状细胞 (dendriticcell,DC)后 ,能否诱导出gp96 多肽复合物特异性的细胞毒性T细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)反应。方法 从一例肺癌患者肿瘤组织中提取gp96 多肽复合物和自体肿瘤细胞溶解物 ,分别负载从该患者骨髓血中培养的DC。以不同形式的抗原 /DC疫苗分别刺激由患者外周血中分离的淋巴细胞。采用ELISA法检测淋巴细胞所释放的IFN γ量作为CTL反应的指标 ;以Cr51 释放实验分析致敏后的淋巴细胞对不同靶细胞的裂解和杀伤作用。结果 所有肿瘤抗原致敏淋巴细胞后均可以诱导产生CTL反应 ,其中以gp96 多肽复合物 /DC疫苗诱导释放的IFN γ量最高。肿瘤抗原致敏淋巴细胞后对原代培养的肿瘤细胞的杀伤作用高于PG细胞和K5 62细胞。结论 自体肿瘤组织中提取的gp96 多肽复合物能诱导出肿瘤特异性CTL反应 ,而负载DC后能激发起更强的CTL。

CTL前体频率对CD8＋CTL应答类型的影响

目的:探讨CTL前体的频率对CTL应答类型的影响。方法:用重组鼠IL-4和GM-CSF诱导小鼠骨髓来源DC发育成熟,卵清蛋白-Ⅰ(OVA-Ⅰ)多肽激活DC,流式细胞术(FCM)分析DCOVA表型;用OVA特异CD8+T细胞和DCOVA接种Iab-/-C57BL/6小鼠,FCM检测小鼠体内OVA特异性CTL及特异性CTL对OVA特异性脾细胞的体内细胞毒作用,并观察DCOVA免疫后小鼠肺肿瘤的生长情况。结果:经OVA-Ⅰ多肽刺激后,DC表面有高水平CD11c、CD80、CD54、Iab、Kb分子及pMHCⅠ复合体表达;注射不同剂量(0×106、0.25×106、0.5×106、1×106、5×106)OVA特异性CD8+T细胞后,小鼠外周血OVA特异CTL占CD8+T细胞的百分比分别为0.01%、1.31%±0.21%、2.34%±0.17%、3.11%±0.25%、4.23%±0.32%,注射CD8+T细胞组OVA特异CTL百分比均较对照组明显增高(P<0.05),未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠外周血OVA特异CTL为2.45%±0.22%;各剂量组CFSElow细胞数不变,CFSEhigh细胞随着CD8+T细胞数的增加而逐渐减少,小鼠肺肿瘤数随接种CD8+T细胞数的增加而减少(P<0.05)。结论:增加CTL前体频率可使CTL应答类型由CD4+T细胞依赖型转变为CD4+T细胞非依赖型。

苦瓜蛋白MAP30的HLA-A2/A3限制性CTL表位预测

目的:预测苦瓜蛋白MAP30的HLA-A2/A3限制性CTL表位。方法:应用lasergene7.0和NetCTL-1.2Server对MAP30进行HLA-A2/A3限制性CTL表位预测。结果:MAP30的二级结构含有8个α-螺旋和9个β-折叠股;柔韧性良好氨基酸区域为19-40、99-146、166-273;亲水性指数较高区域为22-45、97-114、117-148、180-198、224-257、265-275;抗原性指数较高区域为19-28、63-71、98-114、118-123、224-246、248-260、262-274;有30个可能CTL表位,综合分析后获得2个HLA-A2和5个HLA-A3限制性CTL表位。结论:MAP30具有潜在的7个HLA-A2/A3限制性CTL表位。

基于HBV核心抗原CTL表位的治疗性多肽在体诱导抗原特异性细胞免疫应答的研究

目的 探讨基于表位的治疗性多肽抗原组分、结构与诱导免疫应答之间的关系。方法 用分子设计的理论和方法 ,设计基于HBV抗原免疫优势性CTL、Th及B细胞表位的 3种治疗性多肽候选疫苗分子 ,经Merrifield固相多肽合成技术合成 ,并经HPLC纯化、鉴定。以BALB c(H 2 d)纯系小鼠为实验对象 ,进行体内免疫学功能研究。结果 所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CTL应答和适度的抗体反应。Th、B细胞表位的引入可增强CTL表位肽的效应。结论 提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中 ,引入B -、Th表位可显著提高CTL表位肽的免疫原性。

乙型肝炎病毒HBcAg免疫优势CTL表位多肽在HBV转基因小鼠体内的免疫学功能研究

目的 探讨基于乙型肝炎 (Hepatitisbvirus,HBV)核心抗原免疫优势细胞毒性T淋巴细胞 (CytotoxicTlympho cyte,CTL)表位的治疗性多肽抗原组分、结构以及在HBV转基因小鼠体内的免疫学功能。方法 用分子设计的理论和方法 ,设计基于HBV核心抗原免疫优势性CTL表位、Pre S2B细胞表位及破伤风类毒素通用TH 表位的治疗性多肽疫苗候选分子 ,经Merrifield固相多肽合成技术合成 ,经高效液相色谱 (HPLC)纯化、鉴定。以HBV转基因小鼠为试验对象 ,进行体内免疫学功能研究。结果 所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CD8+ T细胞应答和适度的抗体反应 ,并抑制HBV特异性抗原的分泌和乙型肝炎病毒复制。结论 提示所设计基于HBV核心抗原免疫优势性CTL表位、Pre S2B细胞表位及破伤风类毒素通用TH 表位的多肽分子可作为乙型肝炎治疗性多肽疫苗候选分子。

两种白血病细胞抗原负载DC的体外诱导特异性CTL应答的比较

目的: 比较树突状细胞(DC)与白血病细胞融合及白血病细胞冻融抗原负载DC两种白血病DC疫苗诱导抗原特异性CTL应答的能力.方法: 采用羟乙基淀粉-Ficoll两步法分离外周血单个核细胞(PBMC), 通过贴壁2 h获得黏附的单核细胞, 用GM-CSF加IL- 4诱导培养5 d收获细胞.将细胞分为4组: A组将K562细胞或原代慢性粒细胞白血病(CML)细胞在500 g/L PEG-100 mL/L DMSO诱导下与DC融合; B组加入相应细胞数量的白血病细胞冻融抗原; C组将K562细胞或CML细胞与DC共培养; D组: 单独DC培养组.融合前以红色荧光染料PKH26标记K562细胞, 采用流式细胞仪(FCM)检测PKH26/FITC-抗HLA-ABC抗体双标细胞并评估融合率.培养的第6天, 加入TNF-α诱导DC成熟, 然后分别与自体T细胞共培养, 用MTT比色法检测各组CTL对靶细胞的杀伤活性.结果: GM-CSF加IL- 4和TNF-α依次诱导成熟的DC具有经典的DC的形态和表型特征, 在PEG-DMSO的介导下, DC与白血病细胞的融合率为(17.33～29.94)%.两种抗原负载方案激活的CTL均对表达K562抗原的细胞具有特异性的细胞毒作用.在效靶比相同时, 融合组诱导CTL的杀伤活性强于冻融抗原致敏DC组.结论: 与冻融抗原致敏的DC相比, DC与白血病细胞融合细胞递呈抗原的效率更高, 体外诱导的CTL特异性杀伤靶细胞的作用更强, 有可能用于白血病的免疫治疗.

CTL识别的HLA-A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位的鉴定

目的: 鉴定CTL识别的HLA A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位。方法: 以细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导树突状细胞(DC), 通过形态学观察和流式细胞术进行鉴定。用表位预测法选取并合成两种肽分子, 分别脉冲成熟的DC, 并刺激HLA- A2+健康人自体CD8+ T细胞。1wk后, 用脉冲肽的自体PBMC以每 7d的间隔刺激该CD8+T细胞 3次。以共接受 4次抗原肽刺激的T细胞作为CTL,用乳酸脱氢酶(LDH)释放试验, 检测CTL对靶细胞的杀伤效应。用酶联免疫斑点法 (ELISPOT), 检测CTL中抗原特异性分泌IFN- γ的T细胞数。结果: 形态学和流式细胞术的结果显示, PBMC可诱生成熟的DC。肽L235(FLPDHINIV)诱导的CTL, 可特异性杀伤L235脉冲的T2细胞和OVA66+、HLA A2+的SW480细胞, 且L235诱导的特异性分泌IFN- γ的T细胞数增加。结论: 卵巢癌相关抗原OVA66的HLA A2限制性CTL表位L235, 能激发对肿瘤抗原的特异性免疫应答, 为制备肿瘤特异性肽疫苗奠定了实验基础。

乙型肝炎病毒抗原表位模拟多肽诱导CTL应答的研究(英文)

目的 应用分子设计技术设计治疗性多肽 ,以探讨基于乙型肝炎病毒 (HepatitisBvirus,HBV)核心抗原优势细胞毒性T淋巴细胞 (CytotoxicTlymphocyts,CTL)表位的多肽设计与启动HLA Ⅰ限制性HBV特异性CD8+ T细胞应答的关系。方法 合成含HBcAg免疫优势CTL表位、Pre S2蛋白优势B细胞表位和破伤风类毒素通用TH 表位的多肽 ,并进行HLA A2 + 人PBMC体外和Balb/c小鼠体内免疫学功能研究。结果 上述多肽可在体内外诱导CD8+ CTL应答。以棕榈酸为分子内佐剂的Palm p4 4可诱导较强的CD8+ CTL应答 ,与单纯多肽比较不需另加佐剂。结论 脂类分子内佐剂可显著提高多肽的免疫原性 ;Palm p4 4可作为乙型肝炎治疗性多肽疫苗设计较有效的候选分子。

结肠癌患者化疗/热化疗前后CD4^+CD25^+T细胞和CTL变化

背景与目的:化疗是内科治疗结肠癌的主要方法之一,热化疗改善患者机体免疫状态的机制尚不清楚。本研究通过观察结肠癌患者化疗/热化疗前后CD4+CD25+调节性T(Treg)细胞及细胞毒T淋巴细胞功能的变化,探讨其临床意义。方法:入选结肠癌Ⅲ期术后患者60例,其中热化疗组30例,以单纯化疗组30例为对照组,收集患者治疗前后外周血,采用流式细胞术检测治疗前后外周血淋巴细胞中CD4+CD25+Treg细胞的表达,并检测患者CTL细胞杀伤功能。结果:⑴结肠癌患者单纯化疗组化疗前CD4+CD25+Treg细胞表达为19±9,化疗后为19±7,差异无统计学意义(F=0.026,P>0.05);热化疗组化疗前CD4+CD25+Treg细胞表达为19±5,化疗后为14±4,差异有统计学意义(F=2.198,P<0.05);⑵结肠癌患者单纯化疗组化疗前细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)为10±3,化疗后为15±5,差异有统计学意义(F=187.801,P<0.05);热化疗组化疗前CTL为12±3,化疗后CTL为18±5,两组比较差异有统计学意义(F=236.097,P<0.05)。即化疗组治疗前后CD4+CD25+Treg细胞变化不明显,而化疗联合热疗组治疗后CD4+CD25+Treg细胞水平显著降低。两组结肠癌患者治疗后CTL细胞杀伤功能均明显增强,以热化疗组增强更明显。结论:热化疗可明显改善结肠癌患者的免疫抑制状态,增强患者的细胞毒T淋巴细胞的功能。化疗联合热疗可提高患者疗效和预后。

HPV16E7抗原HLA-A2限制性CTL表位预测及其合成

目的 预测、合成、纯化及鉴定人乳头瘤病毒E7抗原的HLA A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位 ,为表位抗原特异性鉴定和临床研究提供靶肽。方法 采用超模体、多项式和量化模体方案相结合的方法 ,对靶抗原HPV16E7的HLA A2限制性细胞毒性T淋巴细胞 (CytotoxicTlymphocyte ,CTL)表位进行预测 ,并运用固相合成法合成多肽 ,经RP HPLC纯化及纯度分析 ,用质谱进行定性鉴定。结果 分别预测出了 16个、10个和 3个九肽表位 ,确定其中 5个九肽为候选合成表位 ,各合成肽的纯度都在 95 %以上。经质谱分析 ,各肽的分子量测定值与理论值相符。结论 超模体、多项式和量化模体方案联合应用可提高预测效率 ,避免了在研究E7抗原表位时盲目合成多肽 ;所合成的多肽为高纯度靶肽 。

多CTL表位DNA疫苗诱导特异性CTL应答的研究

目的:构建多CTL表位DNA疫苗诱导特异性CTL应答。方法:将编码两个HCVCTL表位(H-2d)的基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建多CTL表位DNA疫苗。用其免疫BALB/c小鼠后,以经不同CTL抗原肽冲击的P815细胞(H-2d)作为靶细胞,进行CTL杀伤试验。结果:多CTL表位DNA疫苗可诱导机体产生针对其编码的两种HCVCTL表位的特异性CTL免疫应答,且总的特异性CTL杀伤效应增强。结论:通过天然侧翼氨基酸相连的多个CTL表位为编码序列构建的多CTL表位DNA疫苗,不但能诱导机体产生针对各个CTL表位的特异性CTL应答,而且各特异性CTL应答的联合作用可显著增强总的CTL杀伤效应。

基于改进的人工神经网络方法预测CTL表位

为简化细胞病毒T细胞(cytotoxicity T lymphocytek,CTL)表位鉴定方法,应用改进的人工神经网络方法定量研究了短肽与MHC(major histocompatibility complex)分子结合亲合力的关系,并建立了CTL表位的预测模型,得到了预测模型最优性能参数.用此模型对短肽与HLA-A*0201分子结合的805个预测样本进行了预测,预测准确度达到73.8%.对来自黑色素MAGE-2的短肽与MHC分子的结合亲合力也进行了预测,结果较好.

RSV CTL表位与G蛋白片段的融合表达对G蛋白片段诱导的免疫应答的调节作用

目的:观察呼吸道合胞病毒(RSV)的CTL表位F/M2与G蛋白抗原活性片段G1融合表达后,对G1诱导的免疫应答的调节作用。方法:将重组表达质粒pET-DsbA-G1和pET-DsbA-G1F/M2分别转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白DsbA-G1和DsbA-G1F/M2,亲和层析纯化。取上述蛋白,腹腔注射免疫BALB/c小鼠,定期采集血清和脾细胞,用MTT法测定CTL杀伤活性,ELISA测定IgG及其亚类IgG1和IgG2a抗体滴度,空斑抑制实验检测血清中和抗体。结果:经表达和纯化获得了纯度达90%以上的融合蛋白;DsbA-G1F/M2诱导了显著的RSV特异性CTL杀伤活性,而无CTL表位的DsbA-G1则不能诱导产生CTL反应;DsbA-G1F/M2和DsbA-G1均刺激产生了强烈的IgG抗体应答,但DsbA-G1所产生的IgG亚类仅为IgG1,而DsbA-G1F/M2同时诱导了高滴度的IgG1和IgG2a,显著下调了IgG1与IgG2a的比例;二者均诱导了高滴度的中和抗体,但与DsbA-G1相比,DsbA-G1F/M2所诱导的中和抗体滴度有所减弱。结论:CTL表位F/M2与G蛋白片段G1的融合表达产物DsbA-G1F/M2,能够同时诱导细胞免疫和体液免疫应答,CTL的激活下调了IgG1与IgG2a的比例,使得免疫应答更平衡,有利于改善该候选疫苗的安全性。

含HBV PreS2/S的抗体化乙肝基因疫苗可增强乙肝病毒特异性CTL应答

目的:构建乙肝病毒抗原PreS2/S和抗体Fc段的融合分子,观察该抗体化的乙肝疫苗诱导特异性细胞免疫应答的能力及状况。方法:用PCR的方法扩增乙肝病毒抗原PreS2/S和鼠IgG1Fc段基因,依次克隆到载体上;体外转染小鼠肌细胞,观察表面抗原转录水平和蛋白水平的表达情况;基因免疫小鼠,观察其诱导的特异性CTL免疫应答状况。结果:基因克隆融合分子经酶切和测序鉴定构建成功;体外转染实验表明融合分子可以在肌肉细胞中表达;免疫小鼠脾脏细胞用特异性抗原刺激后能产生很强的细胞免疫应答,其中特异性CTL反应明显增强。结论:基于抗体Fc段的抗体化乙肝疫苗能增强机体对HBV的特异性CTL反应,有利于打破HBV感染导致的免疫耐受。

小鼠肝素酶H-2K^b限制性CTL表位预测及其MHC-I亲和力分析

目的预测肿瘤转移相关基因肝素酶的CTL表位,为探索基于肝素酶的抗原表位的免疫治疗奠定基础。方法利用基于超基序、量化基序结合人工神经网络方案开发的H-2Kb限制性CTL表位预测软件,对小鼠肝素酶蛋白的CTL表位进行预测,然后人工合成相关待测表位肽,再对这些合成肽与MHC-I结合亲和力进行检测。结果采用机算机网络系统,预测了5条小鼠肝素酶抗原表位,即mHpa234~241(LGEDFVEL),mHpa351~358(FAAGFMWL),mHpa519~526(FSYGFFVI),mHpa386~393(VDENFEPL),mHpa398~405(LSLLFKKL),MHC亲合力实验表明,与阴性对照肽对比,随着预测肽浓度增加,H-2Kb的表达逐渐增加,与MHC-Ⅰ类分子的亲和力亦逐渐增强,当预测肽浓度达到30μmol/L时,其荧光系数(FI)均大于1.5。结论通过计算机软件预测到的5条小鼠肝素酶CTL表位与MHC-Ⅰ类分子均有较高的结合亲和力,为该表位的下一步体内鉴定及基于小鼠肝素酶抗原表位的肿瘤免疫治疗奠定基础。

PTD-HBcAg融合蛋白经树突状细胞诱导特异性CTL抑制HBV的体外研究

目的:探讨经PTD-HBcAg融合蛋白致敏的树突状细胞(DCs)体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTLs)对HBV的抑制作用。方法:体外分离培养小鼠髓源性DC,加入融合蛋白刺激DC成熟后与T淋巴细胞共培养,ELISA法检测T淋巴细胞上清中IL-2、IL-4、IL-10和INF-γ的分泌水平,流式细胞术检测胞内细胞因子水平,乳酸脱氢酶释放试验检测特异性CTL活性,并对HepG2.2.15细胞上清中HBsAg及HBV DNA水平进行检测。结果:经不同融合蛋白刺激的DCs能有效促进T淋巴细胞的细胞因子分泌,同时融合蛋白PTD-HBcAg组中IL-2(552.7±117.5ng/L)和INF-γ(150.6±7.945ng/L)明显高于HBcAg组中IL-2(420±12.47ng/L)和INF-γ(107.5±12.19ng/L)分泌。流式细胞计数术检测的PTD-HBcAg融合蛋白诱导CTL细胞水平明显高于对照组。经PTD-HBcAg融合蛋白诱导的CTL比HBcAg有明显的特异性杀伤作用(P<0.05),同时对HBsAg及HBV DNA水平有明显的抑制作用。结论:经PTD-HBcAg融合蛋白致敏的DCs能有效刺激T淋巴细胞分泌细胞因子及增加细胞毒T淋巴细胞的表达,并增强特异性CTL活性及对HepG2.2.15细胞上清中HBsAg及HBV DNA水平的抑制。

树突状细胞体外激活的CTL杀伤效应

目的 :研究树突状细胞 (dendriticcell,DC)激活的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的特异性杀伤效应。方法 :从人外周血中分离出外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcell,PBMC) ,在GM -CSF和IL - 4的作用下培养 7天诱导出DC ,然后PBMC或DC为刺激细胞在体外诱导出HBsAg特异性CTL ;在调节好一定浓度靶细胞 (人肝癌细胞系HepG2及人肺腺癌细胞系A5 4 9)中加入效应细胞 (DC或PBMC) ,4 8h后瑞氏染色计数残存细胞数 ,计算杀伤率。结果 :DC激活的CTL对HepG2 杀伤率为 71.6 % ,而PBMC(APC ,非T细胞 )激活的CTL杀伤率为 4 3.8% ,两者有显著性差异 ,P <0 .0 1。此外 ,DC诱导的肝癌细胞抗原特异性CTL对肺癌细胞的杀伤率仅为 2 3%。结论 :DC诱导的CTL比PBMC高效 ,而且具有较高的特异性。

HLA-A2^+供者外周血hCMV特异性CTL的定量及其表型分析

目的:利用加载人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A0201(A2-NLV)四聚体,探讨四聚体染色条件的优化及其在特异性CTL表型分析中的应用。方法:取HLA-A2+供者外周血,以A2-NLV四聚体/PE在不同条件下染色,然后以anti-CD3-FITC和anti-CD8-APC标记,流式细胞术分析染色结果,寻找四聚体最佳染色条件,并分析特异性CTL的表型和活化抗原表达。结果:以全血样进行四聚体染色结果优于分离的PBMC。A2-NLV四聚体用量为0.3μg时,与100μL全血于4℃温育1h,特异性染色效果最佳,而与CD8-T细胞非特异性结合很低。以此优化条件进行特异性CTL表型分析,结果显示CD28阳性的A2-NLV四聚体特异性CTL的百分率较非特异性CTL低,表达CD57的百分率较非特异性CTL高,CD25分子只表达于活化的特异性CTL上。结论:通过对染色条件进行优化可明显提高四聚体染色的特异性,降低非特异性结合,优化的四聚体染色法能用于抗原特异性CTL的表型和功能分析。