CTLA-4 Ig融合蛋白抗小鼠同种心脏移植排斥的效果及其机制

目的 :研究细胞毒性 T淋巴细胞相关抗原 4(CTL A - 4,CD15 2 ) Ig融合蛋白 (CTL A- 4Ig)抗小鼠同种心脏移植排斥的效果及其体内作用的机制。 方法 :以 C5 7BL / 6小鼠为供者 ,BAL B/ c小鼠为受者行异位心脏移植术 ,分别腹腔注射 CTL A-4Ig[10 0μg/ d,共 15次 ]、γ-球蛋白对照抗体及 PBS,观察移植供心的存活时间 ;研究腹腔注射 CTL A- 4Ig后受体小鼠 T细胞对同种抗原反应性的变化以及对 T细胞亚群分化的影响。结果 :同种心脏移植的小鼠腹腔注射 CTL A- 4Ig后 ,移植心脏存活时间较对照组显著延长 ,40 %移植心脏的存活时间长达 2个月以上。 CTL A- 4Ig治疗后诱导受体小鼠 T细胞对同种抗原低反应性 ,但对第三者抗原的反应性无影响。受体血清中的 Th1来源的 IL - 2、IFN-γ均明显低于 PBS对照组 ,而 Th2来源的 IL - 10的水平则明显高于对照组 ,IL- 4未见明显的改变。结论 :CTL A- 4Ig治疗后可通过诱导受体小鼠 T细胞对同种抗原低反应性以及受体 T细胞由 Th1向 Th2分化 ,诱导供者特异性免疫耐受的产生 。

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的 了解CTLA 4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率 ,为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法 用所构建的CTLA 4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞、人成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞 ,应用免疫组化检测CTLA 4Ig的表达情况。结果 与重组腺病毒共培养 6h使HeLa细胞获得转染 ,12h开始表达 ,36h表达达高峰 ;人成纤维细胞 8h获得转染 ,2 4h开始表达 ,6 0h后达高峰 ;人脐静脉内皮细胞 4h获得转染 ,12h开始表达 ,36h后达高峰。结论 CTLA 4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞、人成纤维细胞。

CTLA-4 Ig腺病毒基因治疗联合供体细胞输注诱导混合嵌合体和大鼠心脏移植耐受

目的 在心脏移植手术中实施CTLA 4Ig腺病毒基因治疗并联合术后输注供体骨髓细胞 ,诱导异基因大鼠心脏移植耐受 ,并对相关机制进行研究。方法 将异基因DA大鼠的心脏移植给受体LEW大鼠 ,同时经门静脉输注供体DA的脾细胞 (SC ,3× 10 8)、CTLA 4Ig腺病毒 [( 1～ 5 )× 10 9PFU ml],第 4天由舌静脉输注DA的骨髓细胞 (BMC ,3× 10 8)。观察、记录心脏移植物的存活时间。并对皮肤移植的受体作同样处理 ,观察皮肤移植存活情况。通过MLR、IL 2逆转实验及嵌合体的测定 ,探讨耐受机理 ,并检测了CTLA 4Ig的体内表达、TH1 TH2型细胞因子的表达。结果 单用CTLA 4Ig腺病毒基因治疗 ,或CTLA 4Ig腺病毒基因治疗联合单独的供体脾细胞或骨髓细胞能不同程度地延长异基因心脏移植物的存活 ,但不能延长皮肤移植物的存活。脾细胞、CTLA 4Ig腺病毒和骨髓细胞(SC Ad BMC)处理组的心脏移植物存活时间明显超过其它各耐受诱导组 ,并且能够诱导皮肤耐受。RT PCR实验证明 ,在受体内不同的组织CTLA 4Ig基因的表达量有所不同 ,并且随着时间的推移表达下降。TH1和TH2型细胞因子的检测显示 ,耐受大鼠体内未发现这两类细胞因子的偏移现象。MLR证明耐受大鼠的免疫应答表现为供体特异性降低 ,IL 2逆转实验、嵌合体检测表明 ,该耐受可能与?

CTLA-4Ig治疗C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎的实验研究

目的研究 CTL A- 4Ig在治疗 C5 7BL/ 6小鼠自身免疫性肝炎上的作用。方法通过用 C5 7BL/ 6近交系小鼠的肝特异性抗原与弗氏完全佐剂混合物免疫攻击小鼠 ,随后用 CTL A- 4Ig治疗 ,观察小鼠的临床经过、血生化、肝脏组织学改变。结果随着免疫次数的增多 ,治疗组临床经过、血生化、肝脏组织学改变逐步与正常对照组相似 ,而病理模型组与前两组有明显差异 :血生化可见天冬氨酸氨基转移酶、球蛋白显著升高 ;肝组织学检测可见炎细胞的浸润 ,肝细胞的肿胀、灶性坏死甚至广泛坏死 ;肝组织免疫荧光检测提示有大量免疫球蛋白沉着。结论 CTL A- 4Ig能有效地治疗 C5 7BL /

人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达

目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1(+)-CTLA-4 Ig,用电穿孔仪转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207。将表达质粒转染COS-7细胞,SDS-PAGE、W estern b lot检测转染细胞裂解上清中目的蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1(+)-CTLA-4 Ig质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA-4 Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。结论成功构建了能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,并在哺乳动物细胞中成功表达有生物学活性的重组人CTLA-4 Ig蛋白。

腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞成骨特性研究

目的通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrowmesenchymal stem cells,hM-SCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响。方法采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染hMSCs的绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测确定转染率,观察对比转染前后细胞形态和细胞周期,用免疫细胞化学方法检测转染hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达,转染hMSCs成骨诱导培养3周后进行成骨特异性标记检测。结果分离培养的hMSCs CD105表达阳性,CD34表达阴性。重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hM-SCs的转染率为81.14%,CTLA-4Ig基因转染hMSCs(CTLA-4Ig-hMSCs)的形态无明显变化,生长良好。免疫细胞化学结果显示,CTLA-4Ig-hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达阳性,诱导培养3周的CTLA-4Ig-hMSCs,碱性磷酸酶染色呈强阳性,免疫细胞化学检测骨钙素表达阳性,钙的四环素荧光标记法显示细胞间有钙的沉积。结论腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs能够分泌CTLA-4Ig蛋白,并保持了成骨分化潜能,可用于异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞的应用研究。

CTLA-4Ig与ICAM-1单抗联合DCp诱导同种移植耐受

目的:利用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 Ig融合蛋白(CTLA-4 Ig)和细胞问黏附分子1(ICAM-1)单克隆抗体联合治疗经供者树突状细胞前体(DCp)免疫的移植受者诱导移植耐受。方法:实验分4组:对照组、CTLA-4 Ig组、ICAM-1单抗组和联合组,每组8只BALB／c受鼠。每组均以2×106C57BL／6供者DCp经尾静脉输注受鼠。CTLA-4 Ig组和ICAM 1单抗组分别自DCp输注之日起连续2周向受鼠腹腔内注射CTLA-4 Ig或ICAM-1单抗(0.1 mg／d);联合组以同样剂量两药注射2周;对照组则仅输注DCp。DCp输注1周后4组均行异位心脏移植并观察移植心存活时间,进一步作皮肤移植确认耐受状态。结果:对照组、ICAM-1单抗组和CTLA-4 Ig组的C57BL／6供心平均存活时间分别为(20.13±1.64)d、(45.00±2.62)d和(90.00±3.07)d,联合组8例中除1例存活98 d外,其他7例均超过100 d。前3组C57BL／6来源皮肤平均存活时间分别为(4.25±0.89)d、(9.00±0.76)d和(44.50±3.42)d,联合组8例中1例存活91 d,3例存活95 d,其他4例均超过100 d。结论:在供者DCp输注受者后以ICAM-1单抗和CTLA-4 Ig联合处理受者能够诱导针对供者的耐受状态。

CTLA-4Ig预防小鼠自身免疫性肝炎的实验研究

目的 研究CTLA 4Ig在防治C5 7BL/6小鼠自身免疫性肝炎上的作用。方法 通过用C5 7BL/6近交系小鼠的肝特异性抗原与弗氏完全佐剂混合物免疫攻击小鼠 ,同时用CTLA 4Ig治疗 ,观察小鼠的肝脏组织学改变。结果 随着免疫次数的增多 ,治疗组结果与正常对照组相似 ;而病理模型组发现炎细胞的浸润 ,肝细胞的肿胀、灶性坏死甚至广泛坏死 ,这与正常对照组有明显差异。结论 CTLA 4Ig能有效地预防C5

CTLA-4Ig体外处理血液透析患者单个核细胞对Th1/Th2、Treg/Th17免疫平衡的影响

目的观察CTLA-4Ig体外处理血液透析患者单个核细胞对Th1/Th2、Treg/Th17免疫平衡的影响。方法银川市第一人民医院肾内科收治的20例终末期肾病患者作为观察组,同期20名健康体检者为对照组,分离获得的单个核细胞以RPMI 1640培养基调配细胞浓度为2×106个·m L-1,观察组和对照组均加入CTLA-4Ig 0.4μL(终浓度为1μg·m L-1),空白组加入等体积的细胞培养液。各组细胞经佛波酯、离子霉素和莫能新共同刺激5h后,收集细胞,用ELISA法检测两组细胞上清IFN-γ、IL-4、IL-17的水平,并用RT-PCR检测单个核细胞的Foxp3和视黄酸相关的孤核受体γt(RORγt)的mRNA表达。结果和对照组相比,观察组加入CTLA-4Ig前细胞上清IFN-γ、IL-4和IL-17水平明显升高(P<0.05),RORγτmRNA表达量明显增高,而Foxp3 mRNA表达量明显降低(P<0.05),CTLA-4Ig处理后两组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。观察组CTLA-4Ig处理后IFN-γ、IL-4和IL-17水平均降低(P<0.05或<0.01);Foxp3mRNA表达量明显升高(P<0.01),而RORγτmRNA表达量明显降低(P<0.01)。相关分析显示:IFN-γ、IL-4、IL-17与RORγτ/β-actin相关系数分别为0.985、0.846、0.912(P均<0.01),IFN-γ、IL-4、IL-17与Foxp3/β-actin相关系数分别为-0.983、-0.879、-0.922(P均<0.01)。结论终末期肾病患者微炎症状态下存在Th1/Th2、Treg/Th17失衡,且两者间存在明显的相关性;CTLA-4Ig处理可改善微炎症状态下Th1/Th2、Treg/Th17的失衡。

CTLA-4Ig融合蛋白对ApoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化的抑制作用

【目的】探讨CTLA-4Ig融合蛋白对高脂饮食饲养的载脂蛋白E基因缺陷小鼠(ApoE-/-)动脉粥样硬化病变的抑制作用。【方法】25只10周龄ApoE-/-小鼠,高脂饮食饲养4周后,随机取5只验证AS病变(对照组);剩余20只随机分为4组(每组5只),继续高脂饮食饲养,分别采用CTLA-4Ig、PBS、IgG1腹腔注射,第4组不予处理;8周后取小鼠主动脉进行病理学检查,检测AS相关指标,包括斑块面积/管腔面积比、血管内膜/中膜厚度比,斑块内脂质、胶原和平滑肌细胞含量。【结果】高脂饮食饲养4周后,出现明显AS病变。继续高脂饮食饲养8周,形成典型AS斑块,CTLA-4Ig组、PBS组、IgG1组和空白组的斑块面积/管腔面积比分别为0.27±0.08、0.40±0.08、0.43±0.08和0.46±0.10,较4周时(0.05±0.01)明显增加(P<0.05),4组的血管内膜/中膜厚度比分别为2.6±0.6、6.0±0.9、5.7±0.8和5.9±0.6,高于对照组(0.5±0.1,P<0.05),4组斑块内脂质含量(%)分别为26.0±3.0、40.8±5.7、40.6±3.0和43.2±5.7较4周时明显增加(7.2±1.4,P<0.05)。采用CTLA-4Ig进行干预后,其斑块面积/管腔面积比、血管内膜/中膜厚度比和斑块内脂质含量显著低于PBS、IgG1和空白处理组(P<0.05),而后3组间上述指标的差异无统计学意义(P>0.05);CTLA-4Ig组斑块内胶原含量(16.0±1.1)%高于其他3组[(8.6±1.2)%、(9.2±1.5)%和(9.0±1.3)%,P<0.05)],其斑块内平滑肌细胞含量(11.8±1.0)%明显高于其他3组[(7.8±0.8)%、(7.5±0.9)%和(7.3±0.7)%,P<0.05)],另外3组间上述指标的差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】CTLA-4Ig融合蛋白能够阻抑高脂饮食饲养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化进程,其增加斑块内血管平滑肌细胞生成胶原作用有助增加AS斑块的稳定性。

CTLA-4Ig对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的BAEP、SEP的影响

目的探索CTLA-4Ig转基因治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)的疗效和安全性。方法用AdCTLA-4Ig注射到Wistar大鼠EAE模型侧脑室内,观察临床发病情况和电生理改变,以判断其疗效。结果EAE大鼠侧脑室注射AdCTLA-4Ig后,大鼠EAE发病时间延迟,发病率显著下降。且脑干听觉诱发电位和体感诱发电位反映的中枢传导功能显著改善。结论CTLA-4Ig对EAE有明显疗效。

人CTLA-4Ig腺病毒载体的构建鉴定与表达

目的:运用PAdEasy系统构建了带荧光蛋白的人CTLA-4Ig腺病毒载体,为进一步研究CTLA-4Ig诱导免疫耐受的机制奠定了基础。方法:采用基因技术,将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,利用PAdEasy系统进行重组,然后在293细胞中进行扩增。并进行病毒滴度测定。体外感染人肾小管上皮细胞。结果:酶切鉴定和PCR证明重组人CTLA-4Ig腺病毒载体构建正确。结论:应用PAdEasy细菌内重组技术成功构建了人CTLA-4Ig带荧光腺病毒载体。

AdCTLA-4Ig对EAE的免疫治疗作用

目的验证AdCTLA-4Ig对EAE免疫反应的抑制作用及其免疫机制,为AdCTLA-4Ig用于治疗MS奠定实验基础。方法用AdCTLA4Ig通过侧脑室注射到Wistar大鼠EAE模型体内,观察其对EAE发病情况、病理改变及免疫反应的抑制情况。结果CTLA-4治疗组发病率降低,临床评分降低,发病时间延长。结论AdCTLA4Ig可抑制EAE大鼠的发病、减轻免疫炎性反应。

共刺激阻断剂CTLA-4Ig在体外培养细胞中的表达

目的 鉴定腺病毒介导免疫调节基因CTLA-4lg在体外培养细胞中的表达能力和细胞毒性。方法以小鼠成纤维细胞(NH3T3)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为靶细胞，观察感染强度为100、200、400时CTLA-4lg重组腺病毒转染靶细胞后不同时相细胞存活百分率；以免疫组化检测CTLA-4lg在细胞中的表达。结果转染后2d、4d，转染组两种细胞存活百分率与对照组相比无显著差异；转染后24 CTLA-4kg在NIH3T3和CHO中的阳性表达率分别为96．1％,94．6％结论重组腺病毒对非包装耙细胞毒性很小，能够介导CTLA-4kg基因时耙细胞的高效转染，并使靶细胞高效表达CTLA-4kg，为介导CTLA-4kg基因转染移植物和抗原提呈细胞提供了一种安全有效的载体。

CTLA-4/Ig在CHO/DG44细胞中的高效表达

目的研究CTLA-4/Ig融合蛋白在CHO真核表达系统中的表达,并纯化所表达的CTLA-4/Ig融合蛋白,为其功能研究和临床应用奠定基础。方法将线性化的pMM-CTLA-4-IgG4/WG和pMMGR转染CHO/DG44细胞,对阳性克隆进行无血清悬浮培养,Western blot检测细胞培养液中CTLA-4/Ig融合蛋白的表达,筛选出高效稳定表达CTLA-4/Ig融合蛋白的CHO细胞;Protein A亲和层析纯化所表达的CTLA-4/Ig融合蛋白;SDS-PAGE电泳、Western印迹等对纯化的CTLA-4/Ig融合蛋白的相对分子质量、纯度、抗原特异性进行生物学鉴定。结果筛选出了能高效稳定表达CTLA-4/Ig融合蛋白的CHO细胞;纯化后的CTLA-4/Ig融合蛋白在SDS-PAGE电泳后出现一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带;该蛋白能与羊抗人IgG-HRP抗体特异结合。结论获得了能够高效稳定表达具有生物学活性的CTLA-4/Ig融合蛋白的CHO细胞。

局部转染CTLA-4Ig抑制大鼠异体复合组织移植急性排斥反应的研究

目的:观察腺病毒介导融合基因细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4Ig)局部转染大鼠同种异体移植的复合组织对急性排斥反应的抑制作用。方法:以近交系Brown Norway大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,采用腹部游离皮瓣作为异体复合组织移植(composite tissue allotransplantation,CTA)模型。将受者分为3组,A组(空白对照组):异体皮瓣离体保存时不感染腺病毒,只灌注PBS溶液;B组(阴性对照组):异体皮瓣离体保存时灌注携带增强型绿色荧光蛋白的重组腺病毒(Ad-EGFP);C组(基因治疗组):异体皮瓣离体保存时灌注AdCTLA-4Ig。术后观察各组移植皮瓣的排斥情况及存活天数,进行组织病理学检查,并观察CTLA-4Ig在移植组织中的表达情况及对急性排斥反应的抑制作用。结果:①A组、B组皮瓣移植物平均生存时间分别为(7.8±1.5)天和(7.1±1.6)天,C组移植皮瓣平均存活时间为(10.4±2.3)天,C组存活期长于A组和B组,差异有统计学意义(P<0.01);②移植皮瓣病理学检查:术后第7天,A组与B组移植皮瓣均发生严重急性排斥反应,而C组排斥反应较A组和B组轻微,但C组术后第11天也表现出严重急性排斥反应;③移植前后血清白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)水平:各组移植术后早期发生急性排斥反应时,IL-2均有明显升高,但实验组血清IL-2水平在第3天、第7天时均明显低于两对照组(P<0.01)。结论:建立了一种新的异体复合组织移植局部基因转染模型,皮瓣灌注AdCTLA-4Ig能获得融合基因在移植复合组织中的表达,局部产生的CTLA-4Ig能抑制急性排斥反应的发生,延长移植物存活时间。

CTLA-4Ig对大鼠同种异体肾移植移植肾功能的影响

目的研究CTLA-4Ig对大鼠同种异体肾移植移植肾功能的影响,为CTLA-4Ig作为一种新型的生物免疫抑制剂应用于临床提供实验依据。方法以LEW大鼠作为受体,BN大鼠作为供体,建立大鼠同种异体肾移植模型。受体LEW大鼠随机分四组,每组35只:(1)对照组:术中给予等体积生理盐水;(2)CTLA-4Ig低浓度组:术中给予CTLA-4Ig 1 mg/kg;(3)CTLA-4Ig中浓度组:术中给予CTLA-4Ig 10 mg/kg;(4)CTLA-4Ig高浓度组:术中给予CTLA-4Ig 20 mg/kg。给药途径为腹腔注射。分别于实验前、术后2小时、术后4小时、术后12小时、术后24小时、术后2天及术后3天收集血液标本,检测血浆CTLA-4Ig浓度及血清肌酐水平。结果对照组大鼠血浆中未检测到明显的CTLA-4Ig。给予不同浓度的CTLA-4Ig,大鼠血浆CTLA-4Ig浓度随之变化。给予CTLA-4Ig 1 mg/kg能有效保护同种异体肾移植的移植肾功能,保护作用随着浓度增加而增加,但CTLA-4Ig 10 mg/kg时保护作用已是最大,再加大给药浓度对移植肾功能保护没有意义。结论 CTLA-4Ig能减轻排斥反应,有效保护大鼠同种异体肾移植的移植肾功能。

CTLA-4Ig治疗作用的实验研究进展

控制器官移植后的排斥反应以及治疗风湿性关节炎之类的自身免疫性疾病一直是医学科学领域的难题。传统采用一些非特异的免疫抑制剂比如激素、环孢霉素进行治疗 ,其作用有限 ,而且会导致全身感染、肿瘤发生等副作用。CTLA 4Ig是人CTLA 4分子胞外区与人免疫球蛋白γ1绞链区、CH2、CH3区组成的融合蛋白 ,与B7有高度的亲和力 ,可以阻断B7与CD2 8的结合。它不但可以封闭B7,导致免疫耐受 ,而且可以调节免疫细胞的分化 ,调节免疫反应。因而 ,作为一种人类基因工程生物制剂 ,它在抗移植排斥反应、治疗自身免疫性疾病等方面具有重要的应用价值 。

CTLA_4-Ig对过敏性哮喘作用的研究

目的 通过CTLA4 Ig阻断B7/CD2 8的结合防止CD+4T激活 ,探讨其治疗哮喘的可行性。方法 分别用 6只BALB/C小鼠作为正常、哮喘、治疗组 ,于气道激发后 2 4h进行外周血、支气管肺泡灌洗液 (BALF)细胞计数及分类、细胞因子测定和病理切片。结果 哮喘组BALF细胞数增加、炎性细胞比例上升 ,全身及局部IL- 4水平增高 ,病理示气道慢性炎症性改变 ,治疗组可减轻上述改变 ,两组比较差别有显著性。结论 CTLA4 Ig可引起抗原特异性免疫耐受 ,抑制哮喘反应。