重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的 了解CTLA 4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率 ,为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法 用所构建的CTLA 4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞、人成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞 ,应用免疫组化检测CTLA 4Ig的表达情况。结果 与重组腺病毒共培养 6h使HeLa细胞获得转染 ,12h开始表达 ,36h表达达高峰 ;人成纤维细胞 8h获得转染 ,2 4h开始表达 ,6 0h后达高峰 ;人脐静脉内皮细胞 4h获得转染 ,12h开始表达 ,36h后达高峰。结论 CTLA 4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞、人成纤维细胞。

CTLA-4Ig治疗C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎的实验研究

目的研究 CTL A- 4Ig在治疗 C5 7BL/ 6小鼠自身免疫性肝炎上的作用。方法通过用 C5 7BL/ 6近交系小鼠的肝特异性抗原与弗氏完全佐剂混合物免疫攻击小鼠 ,随后用 CTL A- 4Ig治疗 ,观察小鼠的临床经过、血生化、肝脏组织学改变。结果随着免疫次数的增多 ,治疗组临床经过、血生化、肝脏组织学改变逐步与正常对照组相似 ,而病理模型组与前两组有明显差异 :血生化可见天冬氨酸氨基转移酶、球蛋白显著升高 ;肝组织学检测可见炎细胞的浸润 ,肝细胞的肿胀、灶性坏死甚至广泛坏死 ;肝组织免疫荧光检测提示有大量免疫球蛋白沉着。结论 CTL A- 4Ig能有效地治疗 C5 7BL /

人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达

目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1(+)-CTLA-4 Ig,用电穿孔仪转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207。将表达质粒转染COS-7细胞,SDS-PAGE、W estern b lot检测转染细胞裂解上清中目的蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1(+)-CTLA-4 Ig质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA-4 Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。结论成功构建了能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,并在哺乳动物细胞中成功表达有生物学活性的重组人CTLA-4 Ig蛋白。

腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞成骨特性研究

目的通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrowmesenchymal stem cells,hM-SCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响。方法采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染hMSCs的绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测确定转染率,观察对比转染前后细胞形态和细胞周期,用免疫细胞化学方法检测转染hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达,转染hMSCs成骨诱导培养3周后进行成骨特异性标记检测。结果分离培养的hMSCs CD105表达阳性,CD34表达阴性。重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hM-SCs的转染率为81.14%,CTLA-4Ig基因转染hMSCs(CTLA-4Ig-hMSCs)的形态无明显变化,生长良好。免疫细胞化学结果显示,CTLA-4Ig-hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达阳性,诱导培养3周的CTLA-4Ig-hMSCs,碱性磷酸酶染色呈强阳性,免疫细胞化学检测骨钙素表达阳性,钙的四环素荧光标记法显示细胞间有钙的沉积。结论腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs能够分泌CTLA-4Ig蛋白,并保持了成骨分化潜能,可用于异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞的应用研究。

Ad-CTLA-4Ig基因导入对胰十二指肠移植大鼠免疫耐受的实验研究

目的研究基因转导法导入细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4融合蛋白基因(CTLA-4Ig)对诱导大鼠胰腺移植免疫耐受的作用。方法采用链脲霉素60mg/kg尾静脉一次性注射法诱导建立Wistar大鼠型糖尿病模型。以SD大鼠为供体,糖尿病Wistar大鼠为受体,用体外低温保存状态下对供器官行腺病毒介导CTLA-4Ig基因转导制作异基因大鼠胰十二指肠移植动物模型。术后监测血糖,记录大鼠功能性存活期。术后3、10、17、28d经大鼠眶后静脉取血,应用ELISA法检测血清IL-2表达,Western blot检测人CTLA-4Ig的蛋白表达。结果对照组大鼠功能性存活期为(11±1)d,转导组功能性存活期为(33±4)d(P<0.01);对照组大鼠术后血清中未检测到人CTLA-4Ig蛋白表达,所有转导组存活病例,第10d血清中均有人CTLA-4Ig表达;转导组术后第3d、第10d血清IL-2分别为(33.710±7.803)pg/mL、(47.846±14.050)pg/mL,小于对照组(P<0.01)。结论体外低温保存状态下对供器官行腺病毒介导人CTLA-4Ig基因转导,可以延长大鼠胰十二指肠移植术后功能性存活期,诱导免疫耐受。

CTLA-4Ig预防小鼠自身免疫性肝炎的实验研究

目的 研究CTLA 4Ig在防治C5 7BL/6小鼠自身免疫性肝炎上的作用。方法 通过用C5 7BL/6近交系小鼠的肝特异性抗原与弗氏完全佐剂混合物免疫攻击小鼠 ,同时用CTLA 4Ig治疗 ,观察小鼠的肝脏组织学改变。结果 随着免疫次数的增多 ,治疗组结果与正常对照组相似 ;而病理模型组发现炎细胞的浸润 ,肝细胞的肿胀、灶性坏死甚至广泛坏死 ,这与正常对照组有明显差异。结论 CTLA 4Ig能有效地预防C5

CTLA-4Ig体外处理血液透析患者单个核细胞对Th1/Th2、Treg/Th17免疫平衡的影响

目的观察CTLA-4Ig体外处理血液透析患者单个核细胞对Th1/Th2、Treg/Th17免疫平衡的影响。方法银川市第一人民医院肾内科收治的20例终末期肾病患者作为观察组,同期20名健康体检者为对照组,分离获得的单个核细胞以RPMI 1640培养基调配细胞浓度为2×106个·m L-1,观察组和对照组均加入CTLA-4Ig 0.4μL(终浓度为1μg·m L-1),空白组加入等体积的细胞培养液。各组细胞经佛波酯、离子霉素和莫能新共同刺激5h后,收集细胞,用ELISA法检测两组细胞上清IFN-γ、IL-4、IL-17的水平,并用RT-PCR检测单个核细胞的Foxp3和视黄酸相关的孤核受体γt(RORγt)的mRNA表达。结果和对照组相比,观察组加入CTLA-4Ig前细胞上清IFN-γ、IL-4和IL-17水平明显升高(P<0.05),RORγτmRNA表达量明显增高,而Foxp3 mRNA表达量明显降低(P<0.05),CTLA-4Ig处理后两组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。观察组CTLA-4Ig处理后IFN-γ、IL-4和IL-17水平均降低(P<0.05或<0.01);Foxp3mRNA表达量明显升高(P<0.01),而RORγτmRNA表达量明显降低(P<0.01)。相关分析显示:IFN-γ、IL-4、IL-17与RORγτ/β-actin相关系数分别为0.985、0.846、0.912(P均<0.01),IFN-γ、IL-4、IL-17与Foxp3/β-actin相关系数分别为-0.983、-0.879、-0.922(P均<0.01)。结论终末期肾病患者微炎症状态下存在Th1/Th2、Treg/Th17失衡,且两者间存在明显的相关性;CTLA-4Ig处理可改善微炎症状态下Th1/Th2、Treg/Th17的失衡。

CTLA-4Ig融合蛋白对ApoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化的抑制作用

【目的】探讨CTLA-4Ig融合蛋白对高脂饮食饲养的载脂蛋白E基因缺陷小鼠(ApoE-/-)动脉粥样硬化病变的抑制作用。【方法】25只10周龄ApoE-/-小鼠,高脂饮食饲养4周后,随机取5只验证AS病变(对照组);剩余20只随机分为4组(每组5只),继续高脂饮食饲养,分别采用CTLA-4Ig、PBS、IgG1腹腔注射,第4组不予处理;8周后取小鼠主动脉进行病理学检查,检测AS相关指标,包括斑块面积/管腔面积比、血管内膜/中膜厚度比,斑块内脂质、胶原和平滑肌细胞含量。【结果】高脂饮食饲养4周后,出现明显AS病变。继续高脂饮食饲养8周,形成典型AS斑块,CTLA-4Ig组、PBS组、IgG1组和空白组的斑块面积/管腔面积比分别为0.27±0.08、0.40±0.08、0.43±0.08和0.46±0.10,较4周时(0.05±0.01)明显增加(P<0.05),4组的血管内膜/中膜厚度比分别为2.6±0.6、6.0±0.9、5.7±0.8和5.9±0.6,高于对照组(0.5±0.1,P<0.05),4组斑块内脂质含量(%)分别为26.0±3.0、40.8±5.7、40.6±3.0和43.2±5.7较4周时明显增加(7.2±1.4,P<0.05)。采用CTLA-4Ig进行干预后,其斑块面积/管腔面积比、血管内膜/中膜厚度比和斑块内脂质含量显著低于PBS、IgG1和空白处理组(P<0.05),而后3组间上述指标的差异无统计学意义(P>0.05);CTLA-4Ig组斑块内胶原含量(16.0±1.1)%高于其他3组[(8.6±1.2)%、(9.2±1.5)%和(9.0±1.3)%,P<0.05)],其斑块内平滑肌细胞含量(11.8±1.0)%明显高于其他3组[(7.8±0.8)%、(7.5±0.9)%和(7.3±0.7)%,P<0.05)],另外3组间上述指标的差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】CTLA-4Ig融合蛋白能够阻抑高脂饮食饲养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化进程,其增加斑块内血管平滑肌细胞生成胶原作用有助增加AS斑块的稳定性。

CTLA-4Ig对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的BAEP、SEP的影响

目的探索CTLA-4Ig转基因治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)的疗效和安全性。方法用AdCTLA-4Ig注射到Wistar大鼠EAE模型侧脑室内,观察临床发病情况和电生理改变,以判断其疗效。结果EAE大鼠侧脑室注射AdCTLA-4Ig后,大鼠EAE发病时间延迟,发病率显著下降。且脑干听觉诱发电位和体感诱发电位反映的中枢传导功能显著改善。结论CTLA-4Ig对EAE有明显疗效。

人CTLA-4Ig腺病毒载体的构建鉴定与表达

目的:运用PAdEasy系统构建了带荧光蛋白的人CTLA-4Ig腺病毒载体,为进一步研究CTLA-4Ig诱导免疫耐受的机制奠定了基础。方法:采用基因技术,将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,利用PAdEasy系统进行重组,然后在293细胞中进行扩增。并进行病毒滴度测定。体外感染人肾小管上皮细胞。结果:酶切鉴定和PCR证明重组人CTLA-4Ig腺病毒载体构建正确。结论:应用PAdEasy细菌内重组技术成功构建了人CTLA-4Ig带荧光腺病毒载体。

AdCTLA-4Ig对EAE的免疫治疗作用

目的验证AdCTLA-4Ig对EAE免疫反应的抑制作用及其免疫机制,为AdCTLA-4Ig用于治疗MS奠定实验基础。方法用AdCTLA4Ig通过侧脑室注射到Wistar大鼠EAE模型体内,观察其对EAE发病情况、病理改变及免疫反应的抑制情况。结果CTLA-4治疗组发病率降低,临床评分降低,发病时间延长。结论AdCTLA4Ig可抑制EAE大鼠的发病、减轻免疫炎性反应。

共刺激阻断剂CTLA-4Ig在体外培养细胞中的表达

目的 鉴定腺病毒介导免疫调节基因CTLA-4lg在体外培养细胞中的表达能力和细胞毒性。方法以小鼠成纤维细胞(NH3T3)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为靶细胞，观察感染强度为100、200、400时CTLA-4lg重组腺病毒转染靶细胞后不同时相细胞存活百分率；以免疫组化检测CTLA-4lg在细胞中的表达。结果转染后2d、4d，转染组两种细胞存活百分率与对照组相比无显著差异；转染后24 CTLA-4kg在NIH3T3和CHO中的阳性表达率分别为96．1％,94．6％结论重组腺病毒对非包装耙细胞毒性很小，能够介导CTLA-4kg基因时耙细胞的高效转染，并使靶细胞高效表达CTLA-4kg，为介导CTLA-4kg基因转染移植物和抗原提呈细胞提供了一种安全有效的载体。

CTLA-4Ig融合蛋白对病毒性心肌炎小鼠Foxp3+调节性T细胞的影响

目的探讨细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA-4Ig)对柯萨奇B3病毒(CVB3)病毒性心肌炎(VMC)小鼠的病死率、心肌病理改变、病毒复制和心肌组织中Foxp3+调节性T细胞(Tregs)的影响。方法 106只4～6周龄健康雄性Balb/c小鼠,体质量为12～16 g,随机分为CTLA-4Ig组16只、病毒组40只、IgG组40只及正常对照组10只,CTLA-4Ig组、病毒组和IgG组小鼠腹腔注射半数组织细胞感染量(TCID50)为10-3/L的CVB3 0.15 ml,正常对照组小鼠接种0.15 ml不含病毒的Eagle液。CTLA-4Ig组、IgG组小鼠于接种病毒后6、72 h分别注射CTLA-4Ig(0.1 mg/kg)及IgG(0.1 mg/kg)。接种病毒后第7天处死所有小鼠在光镜下观察心肌病理变化并计算心肌组织病理积分;采用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)检测心肌组织中CVB3 mRNA的表达;采用免疫组织化学法检测Foxp3分子在心肌组织中的表达,并计算Foxp3+Tregs所占浸润细胞数的百分率。结果与病毒对照组相比较,CTLA-4Ig组小鼠病死率降低(80%比50%,P<0.05),心肌组织病理积分下降(1.78±1.05比1.00±0.72,P<0.05),心肌CVB3 mRNA表达减少(3.48±2.89比0.81±1.06,P<0.05);CTLA-4Ig组小鼠心肌组织中Foxp3+Tregs所占浸润细胞数的百分率较病毒组明显增加(9.22±2.28)%比(5.42±1.59)%,(P<0.05)。结论 CTLA-4Ig可减轻VMC小鼠心肌炎症,降低心肌病毒复制及病死率,其机制可能与上调Foxp3+Tregs比、抑制T细胞活化有关。

局部转染CTLA-4Ig抑制大鼠异体复合组织移植急性排斥反应的研究

目的:观察腺病毒介导融合基因细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4Ig)局部转染大鼠同种异体移植的复合组织对急性排斥反应的抑制作用。方法:以近交系Brown Norway大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,采用腹部游离皮瓣作为异体复合组织移植(composite tissue allotransplantation,CTA)模型。将受者分为3组,A组(空白对照组):异体皮瓣离体保存时不感染腺病毒,只灌注PBS溶液;B组(阴性对照组):异体皮瓣离体保存时灌注携带增强型绿色荧光蛋白的重组腺病毒(Ad-EGFP);C组(基因治疗组):异体皮瓣离体保存时灌注AdCTLA-4Ig。术后观察各组移植皮瓣的排斥情况及存活天数,进行组织病理学检查,并观察CTLA-4Ig在移植组织中的表达情况及对急性排斥反应的抑制作用。结果:①A组、B组皮瓣移植物平均生存时间分别为(7.8±1.5)天和(7.1±1.6)天,C组移植皮瓣平均存活时间为(10.4±2.3)天,C组存活期长于A组和B组,差异有统计学意义(P<0.01);②移植皮瓣病理学检查:术后第7天,A组与B组移植皮瓣均发生严重急性排斥反应,而C组排斥反应较A组和B组轻微,但C组术后第11天也表现出严重急性排斥反应;③移植前后血清白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)水平:各组移植术后早期发生急性排斥反应时,IL-2均有明显升高,但实验组血清IL-2水平在第3天、第7天时均明显低于两对照组(P<0.01)。结论:建立了一种新的异体复合组织移植局部基因转染模型,皮瓣灌注AdCTLA-4Ig能获得融合基因在移植复合组织中的表达,局部产生的CTLA-4Ig能抑制急性排斥反应的发生,延长移植物存活时间。

CTLA-4Ig对大鼠同种异体肾移植移植肾功能的影响

目的研究CTLA-4Ig对大鼠同种异体肾移植移植肾功能的影响,为CTLA-4Ig作为一种新型的生物免疫抑制剂应用于临床提供实验依据。方法以LEW大鼠作为受体,BN大鼠作为供体,建立大鼠同种异体肾移植模型。受体LEW大鼠随机分四组,每组35只:(1)对照组:术中给予等体积生理盐水;(2)CTLA-4Ig低浓度组:术中给予CTLA-4Ig 1 mg/kg;(3)CTLA-4Ig中浓度组:术中给予CTLA-4Ig 10 mg/kg;(4)CTLA-4Ig高浓度组:术中给予CTLA-4Ig 20 mg/kg。给药途径为腹腔注射。分别于实验前、术后2小时、术后4小时、术后12小时、术后24小时、术后2天及术后3天收集血液标本,检测血浆CTLA-4Ig浓度及血清肌酐水平。结果对照组大鼠血浆中未检测到明显的CTLA-4Ig。给予不同浓度的CTLA-4Ig,大鼠血浆CTLA-4Ig浓度随之变化。给予CTLA-4Ig 1 mg/kg能有效保护同种异体肾移植的移植肾功能,保护作用随着浓度增加而增加,但CTLA-4Ig 10 mg/kg时保护作用已是最大,再加大给药浓度对移植肾功能保护没有意义。结论 CTLA-4Ig能减轻排斥反应,有效保护大鼠同种异体肾移植的移植肾功能。

CTLA-4Ig治疗作用的实验研究进展

控制器官移植后的排斥反应以及治疗风湿性关节炎之类的自身免疫性疾病一直是医学科学领域的难题。传统采用一些非特异的免疫抑制剂比如激素、环孢霉素进行治疗 ,其作用有限 ,而且会导致全身感染、肿瘤发生等副作用。CTLA 4Ig是人CTLA 4分子胞外区与人免疫球蛋白γ1绞链区、CH2、CH3区组成的融合蛋白 ,与B7有高度的亲和力 ,可以阻断B7与CD2 8的结合。它不但可以封闭B7,导致免疫耐受 ,而且可以调节免疫细胞的分化 ,调节免疫反应。因而 ,作为一种人类基因工程生物制剂 ,它在抗移植排斥反应、治疗自身免疫性疾病等方面具有重要的应用价值 。

CTLA-4Ig抑制嗜酸性粒细胞的抗原呈递过程

目的 探讨嗜酸性粒细胞 (EOS)在体外培养条件下将抗原呈递给致敏T淋巴细胞的机制。方法 应用流式细胞仪检测了小鼠EOS于重组粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子刺激前后表达作为协同刺激因子主要成员的CD80和CD86分子的水平 ;并观察应用细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白 4融合蛋白 (CTLA 4Ig)封闭CD80和CD86分子以阻断协同刺激通路对EOS呈递抗原的影响。结果 小鼠EOS即使新鲜分离也可以表达CD80和CD86 ,经粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子刺激 2 4h后所表达的CD80和CD86水平明显升高 (P <0 0 1) ,CTLA 4Ig明显地抑制EOS的抗原呈递过程。结论 EOS必须提供协同刺激信号才可作为抗原呈递细胞将摄入和处理的抗原信息传递给T细胞 ,从而促使后者出现增殖反应。

CTLA-4Ig融合蛋白抑制apoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化机理研究

目的探讨CTLA-4Ig融合蛋白抑制高脂饮食饲养的载脂蛋白E基因缺陷小鼠（apoE-／-）动脉粥样硬化（AS）的作用机理？方法30只10周龄apoE-／-小鼠，随机分为3组（每组10只），高脂饮食饲养，分别采用CTLA-4Ig、IgG1、PBS腹腔注射（每周2次）。12周后取小鼠主动脉进行病理学检查，检测AS病变相关指标，包括斑块面积／管腔面积比、血管内膜／中膜厚度比，斑块内脂质、胶原和平滑肌细胞含量；取血清检测总胆固醇浓度和CRP、sICAM-1、IFN-1、IL-10、TGF—β1浓度。结果高脂饮食饲养12周后，形成明显AS斑块，但CTLA-4Ig组病变最轻。CTLA-4Ig组、IgG1组和PBS组的斑块面积／管腔面积比、血管内膜／中膜厚度比、斑块内脂质含量和胶原含量差异均有统计学意义（P〈0．05），CTLA-4Ig组斑块面积／管腔面积比、血管内膜／中膜厚度比和斑块内脂质含量均显著低于IgG1组和PBS组（P〈0．05），其斑块内胶原含量高于IgG1组和PBS组（P〈0．05），而后2组间上述指标的差异均无统计学意义（P〉0．05）；3组间斑块内平滑肌细胞含量差异不具有统计学意义（P〉0．05）。CTLA-4Ig组、IgG1组和PBS组的血清总胆同醇浓度差异不具有计学意义（P〉0．05），3组的血清CRP、sICAM—1、IFN-γ、IL-10、TGF—β1水平差异均有统计学意义（P〈0．05），CTLA-4Ig组m清CRP、sICAM-1、IFN-1水平降低，血清IL-10、TGF-β1水平升高，而后2组间上述指标的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论CTLA-4Ig融合蛋向抑制高脂饮食饲养的apoE（-／-）小鼠动脉粥样硬化进程，可能与阻断B7／CD28通路、抗炎作用、促进Th2檄化、及影响凋节性T细胞功能等有关。

CTLA-4Ig在诱导器官移植免疫耐受中的研究新进展

目前器官移植最大障碍依然是术后排斥反应的发生。因此，寻找诱导免疫耐受的方法一直是器官移植领域的研究热点。抗原特异性T细胞的有效活化除需要TCR识别抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）提呈的MHC一肽作为第一信号外，还必需有APC和T细胞表面的共刺激分子之间相互作用所提供的共刺激信号作为第二信号才能顺利完成，阻断该第二信号而仅有第一信号则可以引起T细胞克隆无能甚至是凋亡，从而诱导器官移植免疫耐受。