CTLA4 Ig在诱导小鼠心脏移植免疫耐受中的作用

目的 通过建立小鼠心脏移植模型 ,探讨CTLA4Ig在免疫抑制和诱导免疫耐受中的作用。方法 建立小鼠心脏移植模型 ,供体分别为DBA/2和 6 15新生鼠心脏 ,受体为BALB/c小鼠 ,移植后分别予以CTLA4Ig 0 .1、1、5mg·kg-1·d-1,治疗 1周 ,观察不同剂量CTLA4Ig对新生鼠移植心脏存活时间的影响 ;BALB/c小鼠首次移植 2周后再次移植DBA/2或 6 15新生鼠心脏 ,观察CTLA4Ig对再次移植心脏存活的影响。结果 与对照组相比 ,CTLA4Ig 0 .1mg·kg-1·d组 ,移植心脏的存活时间不能延长 ,CTLA4Ig 1mg·kg-1·d和 5mg·kg-1·d-1组能显著延长心脏的存活时间 ,但两组间差异不显著 (P >0 .0 5 )。再次移植 6 15心脏各组 ,移植心脏的存活时间均无显著延长 ,而再次移植DBA/2新生鼠心脏 ,CTLA4Ig 1mg·kg-1·d-1和 5mg·kg-1·d-1组 ,其移植心脏的存活时间仍然能显著延长 (P <0 .0 1)。结论 CTLA4Ig能延长新生鼠心脏移植存活时间 。

CTLA4Ig基因转染猪皮敷料对患儿Ⅱ度烧伤炎症反应的影响

目的:观察人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 immunoglobulin,CTLA4Ig)基因转染猪皮敷料在患儿Ⅱ度烧伤治疗中对炎症反应的影响。方法:抽取我院基因转染猪皮治疗急性烧伤的患儿40例作为观察组,银离子敷料治疗烧伤的患儿40例作为对照组。对比两组烧伤患儿的住院时长、发热天数,以及治疗前后的白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(NEUT%)、C-反应蛋白(CRP)、血清降钙素原(PCT)4种炎症指标的表达水平。结果:基因转染猪皮观察组患儿住院时间为(15.23±5.58)d,短于对照组的(18.85±11.47)d。观察组患儿发热天数为(3.60±2.35)d,少于对照组(P<0.05)。观察组患儿治疗后的WBC、CRP、PCT水平均低于对照组,且降低幅度均高于对照组(P<0.05)。结论:CTLA4Ig基因转染猪皮敷料治疗小儿Ⅱ度烧伤创面具有缩短发热时间、降低炎症反应的优点。

CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植的体外实验研究

目的 探索重组腺病毒载体 (Recombinantadenovirus ,rAdv)介导CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植免疫耐受的分子机制。方法 构建CTLA4Ig重组腺病毒载体 ,转染猪树突状细胞 (DendriticCell,DC) ,以猪表皮细胞匀浆液为刺激原 ,观察DC递呈猪表皮抗原刺激人T细胞增殖、活化及信号转导的影响 ;同时 ,以CTLA4Ig rAdv转染小鼠DC细胞 ,观察该DC膜表面分子CD40、CD80表达。结果 CTLA4Ig转染DC能显著抑制人外周血T淋巴细胞增殖能力 (P <0 .0 1)和T细胞肌醇磷脂信号系统转导活性 ,IL 2分泌亦受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ;转染CTLA4Ig的小鼠DC膜表面分子CD80表达降低 (P <0 .0 5 )。结论 腺病毒介导CTLA4Ig基因转染猪皮能诱导人外周血T淋巴细胞免疫耐受。

共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组的腺病毒载体。 方法 将CTLA4IgcDNA插入腺病毒表达质粒 ;将重组质粒与腺病毒基因组质粒共转染 2 93细胞 ,产生重组腺病毒 ;采用dot ELISA和PCR法筛选并获得CTLA4Ig阳性表达的重组腺病毒。结果 同源重组后 ,以dot ELISA法筛选到 2个 2 93细胞的CTLA4Ig蛋白阳性表达空斑 ,PCR证实为含CTLA4Ig基因和腺病毒基因的重组体AdvCTLA4Ig。结论 本研究构建了CTLA4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA4Ig 。

CTLA4Ig基因表达对鼠皮肤移植免疫抑制作用的研究

目的 探讨静脉注射CTLA4Ig腺病毒后在大鼠体内的表达和对同种异体移植皮肤存活的影响 ,以及该载体应用的安全性 ,为该基因治疗方法在抑制器官移植排斥反应的临床应用奠定基础。方法 供体SD大鼠皮肤移植前 1周 ,用腺病毒作载体将CTLA4Ig导入Wistar大鼠体内 ,用蛋白质斑点印迹实验检测血清中CTLA4Ig的表达 ,用腺病毒荧光抗体检测腺病毒在脏器的分布。同时还观测了各脏器的病理改变及移植物生存时间。结果 CTLA4Ig腺病毒在肝、脾、心、肺、肾均有明显分布 ,但实质细胞均未见严重损伤性改变。CTLA4Ig基因能在血清中的表达高峰时间一般在 7d左右 ,移植皮肤的生存显著长于对照组 (P <0 .0 5 )。结论 从静脉注射导入的CTLA4Ig基因能在大鼠体内表达并对同种移植的排斥反应有明显的抑制作用。

腺病毒介导CTLA4Ig基因在体外培养细胞中的表达

目的 鉴定腺病毒介导免疫调节基因CTLA4Ig在体外培养细胞中的表达能力和细胞毒性。 方法 以肾小管上皮细胞(PK 15 )、血管内皮细胞 (ECV 3 0 4)为靶细胞 ,观察感染强度为 10 0、2 0 0、40 0时CTLA4Ig重组腺病毒转染靶细胞后不同时相细胞存活百分率 ;以免疫组化以及Westernblot分别检测CTLA4Ig在细胞以及上清中的表达。 结果 转染后 2d、4d ,转染组两种细胞存活百分率与对照组相比无显著差异 ;转染后 2 4hCTLA4Ig在PK 15和ECV 3 0 4中的阳性表达率分别为 93 7%和 90 2 % ;Westernblot检测到两种细胞上清中均有CTLA4Ig表达。 结论 重组腺病毒对非包装靶细胞毒性很小 ,能够介导CTLA4Ig基因对靶细胞的高效转染 ,并使其表达分泌型CTLA4Ig ,具备了以基因治疗诱导免疫耐受的潜能 。

CTLA4Ig诱导免疫耐受的体外研究

目的 观察CTLA4Ig在诱导人外周血T细胞免疫耐受中的作用。方法以结核菌素刺激人外周血淋巴细胞,观察不同剂量CTLA4Ig对外周血淋巴细胞增殖反应的影响;观察CTLA4Ig和CsA(环孢霉素A)对再次结核菌素刺激和非相关第三者APC细胞刺激淋巴细胞增殖反应的影响,IL-2的变化,以及外源性IL-2对免疫耐受诱导的影响。结果CT-LA4Ig抑制淋巴细胞增殖呈剂量依赖关系,20μg/ml时抑制作用最强;CTLA4Ig能诱导免疫耐受并与CsA有协同作用;外源性IL-2能抑制免疫耐受的诱导。结论CTLA4Ig能抑制淋巴细胞的增殖和IL-2的分泌释放,CTLA4Ig和CsA联合应用能更彻底抑制淋巴细胞增殖和IL-2的分泌释放,并诱导免疫耐受;外源性IL-2能逆转免疫耐受。

CTLA4Ig局部转基因对小肠移植急性排斥的治疗作用

目的:研究CTLA4Ig基因在移植小肠局部表达及其表达产物对急性排斥反应的治疗作用. 方法:建立SD→Wistar的大鼠异位小肠移植模型,并随机分为实验组(CTLA4Ig转基因组)和对照组(非转基因组). 实验组供肠移植前经肠系膜上动脉注入脂质体包裹的CTLA4Ig cDNA,术后应用免疫组织学检查移植小肠中CTLA4Ig转基因产物的表达.移植术后3,7,10 d分别获取各组的移植小肠进行组织学检查及细胞凋亡测定. 结果:经CTLA4Ig cDNA处理的小肠在移植术后可见大量的CTLA4Ig表达.对照组移植肠在术后7,10 d分别出现I, Ⅱ度急性排斥反应,同时凋亡细胞数量显著增加.实验组移植肠术后未见排斥反应的病理学证据,凋亡细胞偶见. 结论:CTLA4Ig基因可在移植小肠局部转染表达,其表达产物可防止移植术后急性排斥反应的发生.

重组腺病毒介导的CTLA4Ig基因在哺乳动物体内表达的研究

目的 了解CTLA4Ig腺病毒在不同哺乳动物体内的转染能力及表达情况。方法 用所构建的CTLA4Ig腺病毒通过静脉或腹腔注射到Balb/c小鼠、Wistar大鼠、兔、小香猪、羊体内 ,应用蛋白质斑点印记检测CTLA4Ig在以上动物血清中的表达情况 ,同时还观察各动物脏器的病理改变及动物的生存情况。结果 重组腺病毒转染 7d后大鼠、小鼠血清中出现CTLA4Ig ,持续表达 2周。各动物未见异常死亡 ,各脏器未见明显病理改变。结论 CTLA4Ig重组腺病毒能够有效转染Balb/c小鼠。

CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达

目的 :构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体 ,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。方法 :自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物 ,以质粒PCDNA3 0 /CTLA4Ig为模板 ,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基因全部序列。片段回收以后经BglⅡ及HindⅢ双酶切 ,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV的启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间 ,获得重组质粒pAdTrack -CTLA4Ig。通过BglⅡ /HindⅢ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后 ,将正确重组体pAdTrack -CTLA4Ig与腺病毒骨架质粒pAdEasy - 1共转化BJ5 183细菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆 ,提取质粒用脂质体介导转染 2 93细胞 ,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果 :成功构建了含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒 ,病毒滴度为 1 6 5× 10 12 PFU/L。结论 :该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达、研究CTLA4Ig的生物学活性及移植排斥、自身免疫病的基因治疗提供了一定的基础。

人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。

CTLA4Ig基因修饰的BMSCs支持CD34^+细胞扩增的实验研究

目的 通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞 (BMSCs)中的表达 ,探讨CTLA4Ig基因修饰的BMSCs支持CD34+ 细胞扩增的功能变化 ,为该基因修饰的BMSCs联合造血干细胞移植 (HSCT) ,达到预防移植物抗宿主病 (GVHD )和纠正预处理损伤的造血微环境 (HIM)积累实验依据。方法 以CTLA4Ig 重组腺病毒按感染复数 (Multiplicityofinfection ,MOI) 5 0转染BMSCs ,以RT PCR检测目的基因转录 ;免疫磁珠 (MACS)阳性选择分选骨髓CD34+ 细胞 ,流式细胞仪检测其纯度 ;通过骨髓基质细胞支持CD34+ 扩增的细胞总数及集落形成细胞数 (CFC)的变化 ,比较转染和未转染BMSCs在支持CD34+ 细胞扩增方面的差异。结果 RT PCR在转染组及转染后传两代BMSCs中检测到CTLA4Ig基因的转录 ;通过观察扩增后细胞总数及CFC数的变化 ,发现CTLA4Ig基因转染组与未转染组BMSCs支持CD34+ 细胞扩增的能力也无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 CTLA4Ig 重组腺病毒有效介导目的基因对BMSCs的转染 ,在MOI为 5

GPI-CTLA4Ig嵌合分子的构建和在CHO-dhfr^-细胞膜上的表达

目的 :研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI CT LA4Ig。方法 :通过将从促衰变因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合 ,获得GPI修饰的CTLA4Ig分子。将编码GPI CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI dhfr中 ,并用脂质体法转染CHO dhfr 细胞 ,用氨甲喋呤 (MTX)进行筛选。重组蛋白的表达用RT PCR、ELISA、细胞免疫荧光和Westernblot进行鉴定。最后采用ProteinA亲和层析纯化。结果 :构建了GPI CTLA4Ig嵌合分子 ,并在CHO dhfr 细胞膜上稳定表达。结论 :GPI修饰的CTLA4Ig分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中 。

Tju103和CTLA4-Ig诱导MHC半相合小鼠骨髓移植耐受比较

目的:观察Tju103和CTLA4-Ig各自对MHC半相合小鼠骨髓移植免疫耐受的诱导。方法:半相合供鼠T细胞与受鼠抗原、Tju103(或CTLA4-Ig)共育后与骨髓细胞混合移植,观测移植后受情况。结果:A.单纯照射组:全部小鼠于照射后11d内死于造血衰竭;B.白血病CTX治疗组:全部小鼠于接种白血病细胞后16～23d死于白血病;C.单纯移植组:全部小鼠于移植后21d内死于移植物抗宿主病(GVHD);D.CsA预防组:5只小鼠于移植后8～22d死亡,1只死于白血病,各有2只死于GVHD和感染,5只活过30d;E.Tju103处理组:4只小鼠于移植后9～26d死亡,2只死于GVHD,各有1只死于白血病和感染,6只活过30d;F.CTLA4-Ig处理组:2只小鼠于移植后17～26d死亡GVHD,8只活过30d。结论:Tju103和CT-LA4-Ig均明显延长生存期,降低GVHD发生和严重程度,CTLA4-Ig保留有抗感染和移植抗白血病(GVL)作用,而Tju103没有。

人CTLA4Ig腺病毒载体的构建及其生物学功能研究

目的:通过同源重组构建CTLA4Ig腺病毒载体,研究其生物学活性,并用于基因治疗诱导心脏移植耐受。方法:通过基因重组技术,将CTLA4Ig基因克隆至腺病毒穿梭质粒pCA13中。然后将该质粒与腺病毒辅助质粒同源重组,经过293细胞包装,构建CTLA4Ig腺病毒载体。用RT-PcR、SDS-PAGE及Western blot等技术,检测包装的病毒感染293细胞后CTLA4Ig蛋白的表达及分泌,通过体外实验,观察病毒感染的293细胞上清对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。通过大鼠体内实验,检测用CTLA4Ig腺病毒载体基因治疗后,CTLA4Ig在体内的表达。结果:CTLA4Ig腺病毒载体构建成功。体外实验证实,CTLA4Ig腺病毒感染的293细胞上清液,能够抑制异基因脾细胞的单向MLR。体内实验表明,经过静脉途径给予受体大鼠CTLA4Ig腺病毒载体,能够诱导移植耐受,延长心脏移植物的存活。结论:构建的CTLA4Ig腺病毒载体,体外感染293细胞能够分泌CTLA4Ig蛋白。该蛋白可抑制T细胞的活化,CTLA4Ig腺病毒载体可用于体内基因治疗诱导移植耐受。

腺病毒介导CTLA4Ig转染正常人肝细胞株的研究

目的研究腺病毒介导CTLA4Ig基因转染正常人肝细胞株L02后,CTLA4Ig在L02细胞内的表达、生物学活性以及对L02细胞生物学特性的影响。方法重组腺病毒载体Ad-CTLA4Ig-EGFP转染体外培养的正常人肝细胞株L02,观察绿色荧光在细胞内的表达情况。以免疫细胞化学、Western blot、ELISA等方法检测CTLA4Ig在L02细胞内、外的表达情况;通过绘制细胞生长曲线、检测尿素合成能力观察转染前后L02细胞的生物学特性;转染后的L02细胞与大鼠脾脏细胞共培养,通过检测脾脏细胞增殖情况评价表达CTLA4Ig的L02细胞在体外的免疫耐受活性;收集共培养体系中的大鼠脾脏细胞,再分别与正常L02细胞、HeLa细胞共培养,检测脾细胞增殖情况以评价转染后L02细胞免疫耐受的特异性。结果转染后的L02细胞可在细胞质内大量表达CTLA4Ig蛋白,并分泌至培养上清中;转染后L02细胞生长速度无明显改变(P>0.05),单个细胞尿素合成能明显升高[(0.56±0.01)pmol/d,P<0.01];转染后的L02细胞在体外可显著抑制大鼠脾脏细胞的增殖(抑制率约为36.8%,P<0.05),被抑制后的大鼠脾脏细胞在正常L02细胞刺激下增殖较低,但在HeLa细胞刺激下则可显著增殖(P<0.01)。结论Ad-CTLA4Ig-EGFP转染后的L02细胞可表达具有生物学活性的CTLA4Ig,并在体外表现出显著的具有抗原特异性的免疫抑制活性。

CTLA4Ig和CD40LIg基因修饰骨髓间充质干细胞在异种胰岛移植排斥反应中的作用

目的探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)和T细胞分化群40补体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)在异种胰岛移植排斥反应中的作用及其可能的机制。方法将SD大鼠胰岛细胞移植到Wistar糖尿病大鼠肾包膜下,建立SD-Wistar大鼠的异种胰岛移植模型,用携带CTLA4Ig和CD40LIg基因重组腺病毒感染的MSCs进行干预治疗。取造模成功的糖尿病大鼠45只,按随机数字表法分为3组(每组15只):对照组只植入胰岛细胞;单纯MSCs组植入胰岛细胞和MSCs;基因转染MSCs组植入胰岛细胞及CTLA4Ig和CD40LIg基因转染的MSCs。观察胰岛移植后糖尿病大鼠的生存情况、血糖变化和移植物病理形态学的改变,检测移植物CTLA4Ig、CD40LIg和胰岛素的表达以及胰岛移植大鼠细胞因子水平的变化。结果①糖尿病大鼠血糖在移植后2 d降至正常,对照组血糖平均在移植后8 d升高,单纯MSCs组和基因转染MSCs组血糖分别在21 d和49 d升高。②对照组、单纯MSCs组和基因转染MSCs组,移植物存活时间分别为(10.2±2.1)、(23.5±6.8)和(52.1±7.3)d,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05);移植大鼠的生存时间分别为(21.3±5.3)、(49.7±8.5)、(95.8±13.8)d,各组间比较和移植物存活时间相似(P<0.05)。③对照组TNF-α和IL-2的水平在移植后1周内均急剧上升,而IL-4和IL-10的水平较移植前显著下降(P<0.01);2个治疗组细胞因子水平的变化和对照组正好相反。④2个治疗组移植物内可见成片的胰岛细胞团,未见明显淋巴细胞浸润,基因转染MSCs组移植物内可见CTLA4Ig、CD40LIg和胰岛素的表达。结论转移CTLA4Ig和CD40LIg基因修饰MSCs可抑制异种胰岛移植排斥反应,其效果优于MSCs单独应用。

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰骨髓间质干细胞体外抑制免疫应答的研究

目的:通过腺病毒载体介导CTLA4Ig在大鼠骨髓间质干细胞(MSC)中的表达,探讨MSC作为基因转移靶细胞的可行性和转染效率,研究其在体外对免疫应答的抑制作用。方法:构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体pad-CTLA4Ig,按照不同的感染倍率(MOI)转染大鼠MSC,用荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,流式细胞术、Western blotting等方法检测目的蛋白CTLA4Ig在MSC中的表达。将转基因MSC加入混合淋巴细胞反应(MLR)体系,观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应。结果:重组腺病毒载体pAd-CTLA4Ig对MSC的最大转染率为80.7％±4.7％,转基因MSC可检测到目的蛋白的表达。基因修饰的MSC能有效抑制MLR体系中淋巴细胞的增殖,4d达到最大抑制效率51.46％;再次MLR证实这种抑制作用是供者特异性的。结论:MSC是一种较理想的基因转移靶细胞,其表达的转基因产物CTLA4Ig可在体外特异性地抑制免疫应答。

CTLA4-Ig影响T细胞功能及机理的初步研究

目的 :研究CTLA4 Ig融合蛋白对外周血T淋巴细胞活化的抑制作用及机理。方法 :分离新鲜人外周血单个核细胞 ,观察CTLA4 Ig对淋巴细胞转化和混合淋巴细胞培养的作用 ,用流式细胞术观察CTLA4 Ig对T细胞表面CD2 5表达的影响 ,最后通过EMSA方法检测激活T细胞中核蛋白的变化。结果 :CTLA4 Ig能够抑制淋巴细胞转化和混合淋巴细胞反应 ,减低T细胞表面CD2 5的表达 ,抑制核内与IL 2表达相关的RE AP结合因子的活化。结论 :CTLA4 Ig通过多种信号途径对T细胞的活化起作用 ,其机制之一是抑制核内结合于IL 2增强子RE AP位点的核因子的活化。

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞诱导特异性免疫耐受的实验研究

目的 通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs)中的表达 ,探讨CTLA4Ig体外诱导特异性免疫耐受的机制 ,为该基因修饰的BMSCs联合造血干细胞移植 (hematopoieticstemcelltransplantation ,HSCT) ,达到预防移植物抗宿主病 (graft versus hostdisease ,GVHD)和纠正预处理损伤的造血微环境 (hematopoieticinductivemicroenvironment,HIM)积累实验依据。方法 以CTLA4Ig 重组腺病毒按感染复数 (mutiplicityofinfection ,MOI) 5 0转染BMSCs,利用亲和层析的方法纯化培养上清中的目的蛋白CTLA4Ig ,加入到混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)体系中 ,通过MTT显色观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应 ,以ELISA检测体系中IL 2的水平。结果 纯化的CTLA4Ig对MLR反应体系中淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用 ,且在一定范围内与CTLA4Ig的浓度呈依赖性关系 ;体系中IL 2水平与淋巴细胞数有相似的变化趋势 ,且成正相关 (γ =0 85 2 2 ) ;CTLA4Ig组的淋巴细胞数与IL 2水平与对照组相差显著 (P <0 0 5 )。结论 转染后BMSCs表达的目的蛋白CTLA4Ig能有效阻断B7/CD2 8共刺激信号途径 ,从而抑制T细胞活化 ,抑制IL