ZEA、DON及其联合染毒对CTLL-2细胞因子分泌的影响

为研究镰刀菌毒素玉米赤霉烯酮(ZEA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)及其联合作用对动物免疫功能的影响,试验以CTLL-2细胞(细胞毒性T淋巴细胞株)为材料,用不同浓度的ZEA(0、5、10、20μg/mL)、DON(0、0.5、1、2μg/mL)及联合(空白组、5μg/mL ZEA、0.5μg/mL DON、5μg/mL ZEA+0.5μg/mL DON)处理CTLL-2细胞48h,采用ELISA法检测了细胞内及培养上清液中颗粒酶B(GZMB)、穿孔素(PFP)、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子的含量。结果显示,ZEA、DON能够降低CTLL-2细胞胞内及培养上清液中PFP、GZMB、IFN-γ的浓度,增加TNF-α浓度,染毒组与对照组相比均有显著或极显著差异(P<0.05;P<0.01),且均呈剂量效应关系;ZEA、DON联合染毒表现为加性效应。结果表明,ZEA、DON及其联合作用可通过影响免疫细胞因子的分泌,降低免疫细胞杀伤活力,间接影响机体体液免疫和细胞免疫的负调节,从而导致动物机体免疫机能下降。

ZEA与DON联合染毒对CTLL-2细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase3等表达的影响

为了探讨玉米赤霉烯酮(ZEA)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)联合作用对免疫系统毒性影响及其毒理机制,试验以T淋巴细胞株(CTLL-2)为材料,在利用CCK-8试验确定ZEA、DON对CTLL-2细胞联合染毒浓度的基础上,研究了ZEA与DON联合染毒对CTLL-2细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3等表达的影响,试验设对照组、ZEA染毒组(5μg/m L ZEA)、DON染毒组(0.5μg/m L DON)、ZEA+DON联合染毒组(5μg/m L ZEA+0.5μg/m L DON),染毒时间为48 h,用流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western-blot检测Bax、Bcl-2和Caspase级联反应相关蛋白的表达情况。结果表明:与对照组相比,各染毒组CTLL-2细胞的凋亡率均极显著升高(P<0.01);各染毒组细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值和Cleaved Cspase-3、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-9等蛋白的表达量均较对照组显著升高(P<0.05或P<0.01);联合染毒组呈现协同效应。说明ZEA与DON联合染毒在诱导免疫细胞凋亡方面发挥协同效应,它们共同存在可以发挥更强的免疫抑制效应;ZEA与DON联合染毒诱导CTLL-2细胞发生凋亡的机制与Bax/Bcl-2上调的线粒体通路密切相关。

CTLL-2/MTT法快速测定IL-2基因转移效率的研究

应用包装ＩＬ－２基因的逆转录病毒载体，将ＩＬ－２基因导入小鼠成纤维细胞ＮＩＨ－３Ｔ３和小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，建立了ＮＩＨ－３Ｔ３／ＩＬ－２－２，ＮＩＨ－３Ｔ３／ＩＬ－２－７和Ｂ１６／ＩＬ－２－４等３个转基因细胞株，应用ＣＴＬＬ－２／ＭＴＴ法快速测定各转基因细胞株分泌上清ＩＬ－２的浓度．转染效率最高的ＮＩＨ－３Ｔ３／ＩＬ－２－７其ＩＬ－２分泌量高达１４２２ｕ／（１０６ｃ·２４ｈ），表明这一基因转移系统能有效地将外源基因导入靶细胞．ＣＴＬＬ－２／ＭＴＴ法能快速、简便、有效地检测ＩＬ－２的表达．

细胞克隆化对CTLL-2细胞纯化的研究

本文介绍CTLL-2细胞在培养中出现不正常,影响检测效果时,利用细胞克隆化方法、克服因重新复苏细胞等条件延误检测结果。提高克隆化纯度细胞,优选细胞最佳期,从而使CTLL细胞检测更敏感,更准确。

玉米赤霉烯酮诱导CTLL-2细胞凋亡途径的研究

为探讨玉米赤霉烯酮(ZEA)对免疫细胞凋亡途径的影响,以细胞毒性T淋巴细胞株(C TLL-2)为材料,用不同浓度的ZEA(0、0.8、3.2、12.8、25.6 g/mL)处理CTLL-2细胞48 h,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western-blot检测Fasl、Fas、Cleaved-Caspase 9、Cleaved-Caspase 3、Bcl-2和Bax等蛋白的表达情况。结果显示,随着ZEA浓度的增加,CTLL-2细胞的凋亡率呈上升趋势,3.2 g/mL ZEA以上染毒组均较对照组有极显著差异(P<0.01);Bax蛋白的表达呈上升趋势,而Bcl-2蛋白的表达量呈下调趋势,Bax/Bcl-2的比值升高且呈剂量效应关系;Caspase 3蛋白表达量呈下调趋势,3.2 g/mL ZEA以上染毒组均较对照组有极显著差异(P<0.01);各染毒组Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9、Fasl和Fas蛋白表达量均较对照组极显著升高(P<0.01)。结果表明,玉米赤霉烯酮可以通过线粒体途径和死亡受体途径诱导CTLL-2细胞凋亡,影响动物的免疫机能。

锤头状核酶抑制CTLL-2细胞凋亡而增强其对Yac-1细胞杀伤活性的实验研究

目的 研究抗fas的锤头状核酶对小鼠细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)系CTLL 2细胞fas基因的表达及其介导的细胞凋亡抑制作用 ,探索供者淋巴细胞输注 (DLI)时增强T细胞抗白血病的新途径。方法设计并合成抗fas的锤头状核酶基因 ,将其导入CTLL 2细胞 ,通过RT PCR、Westernblot和流式细胞仪分别检测核酶对CTLL 2细胞fasmRNA和Fas蛋白表达的抑制 ,以MTT法检测CTLL 2细胞与Fas抗体结合后的增殖活性 ,以半胱天冬酶 3(caspase 3)活性检测试剂盒检测细胞caspase 3蛋白酶活性 ,以流式细胞仪检测细胞凋亡 ,以乳酸脱氢酶法检测CTLL 2细胞的体外杀伤活性。结果锤头状核酶基因导入CTLL 2细胞后 ,可使其表面的Fas表达降低达 5 0 % ,细胞经Fas抗体 (JO2 )处理后 ,与空白对照、转染空载体的细胞相比 ,转染核酶的细胞增殖活性增加了 1倍 ,caspase 3活性降低近 5 0 % ,而细胞的凋亡率显著降低 ,只有 37% ,且CTLL 2细胞的体外杀伤活性为对照组的 2倍。结论该核酶具有切割fas基因的良好活性 ,并可抑制Fas介导的CTLL 2细胞凋亡 ,增加该细胞存活率 ,从而增强对Yac 1细胞的杀伤活性。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导CTLL-2细胞凋亡的信号途径研究

为探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)对动物免疫功能的影响及其机理,以细胞毒性T淋巴细胞株CTLL-2为材料,用不同浓度的DON(0、0.5、1、2μg/m L)处理CTLL-2细胞48h,流式细胞术检测细胞的凋亡率,免疫印记法检测细胞凋亡相关通路蛋白CleavedCaspase 9、Cleaved-Caspase 3、Fas L、Fas、Cleaved-Caspase8等表达情况;并用流式细胞术检测了DON(1μg/m L)与Fas L中和抗体(10μg/m L)共处理后细胞的凋亡率。结果表明,随着DON浓度的升高,CTLL-2细胞的凋亡率呈上升趋势,染毒组均较对照组有极显著差异(P<0.01);Bax/Bcl-2的比值升高,呈剂量-效应关系;DON促进细胞色素c(Cyt-c)从线粒体中释放到胞浆中,能够上调Cleaved-Caspase 9、Cleaved-Caspase 3的表达,染毒组均较对照组有显著性或极显著差异(P<0.05或P<0.01);Fas L、Fas、Cleaved-Caspase 8蛋白表达量随着DON浓度的升高逐渐增加,染毒组均较对照组有显著性或极显著差异(P<0.05或P<0.01);随着DON浓度的升高,p38 MAPK、JNK、Erk的磷酸化水平也升高,呈剂量-效应关系;与DON处理组相比,Fas L中和抗体与DON共同处理组细胞凋亡率明显下降(P<0.01)。结果表明,DON可以诱导CTLL-2细胞发生凋亡,激活CTLL-2细胞线粒体通路、MAPKs通路,DON通过死亡受体途径诱导CTLL-2细胞凋亡,影响动物的免疫机能。

人重组C3片段通过IL-2自分泌效应对CTLL-2细胞产生促增殖作用

目的研究补体Ｃ３片段的体外生物学活性及其作用机理，进一步探讨Ｃ３片段与免疫细胞的关联。方法利用重组ＤＮＡ技术表达纯化Ｃ３活性片段（命名为Ｃ３３），观察其对ＩＬ－２依赖性的小鼠杀伤性Ｔ细胞株ＣＴＬＬ－２细胞的促增殖效应，并通过抗体封闭途径和分子杂交技术研究Ｃ３３作用的机理。结果发现Ｃ３３蛋白对ＣＴＬＬ－２细胞具有明显的促增殖作用，并呈剂量依赖关系；这一作用能够部分地被抗小鼠ＣＤ１１ｂ抗体所封闭，能够完全被抗小鼠ＩＬ－２抗体所封闭；分子杂交显示Ｃ３３蛋白能够明显刺激ＣＴＬＬ－２细胞的ＩＬ－２ｍＲＮＡ表达。结论人重组Ｃ３片段Ｃ３３可通过ＩＬ－２的自分泌效应对ＣＴＬＬ细胞产生促增殖作用，补体受体ＣＲ３参与这一作用。

人PBL及CTLL-2/HIL-4R细胞系对人IL-4增殖应答的特性

本文分析了３０例正常人ＰＲＬ经ＰＨＡ活化的Ｔ细胞对ＩＬ－２及ＩＬ－４的增殖应答特点；及整合有人ＩＬ－４受体ｃＤＮＡ的ＣＴＬＬ－２／ＨＩＬ－４Ｒ细胞系对人ＩＬ－４的特异增殖应答特点。结果表明，正常人经ＰＨＡ活化的ＰＢＬ对ＩＬ－２有良好增殖应答曲线者占９３％，而对ＩＬ－４有良好增殖应答者只占２０％。 ＣＴＬＬ－２／ＨＩＬ－４Ｒ细胞系对人ＩＬ－４呈规律性增殖应答曲线，且应答敏感性高，可测出０．０９ｕ／ｍｌ，可推荐作为测定人ＩＬ－４生物活性的一种准确方法。

白细胞介素-2检验方法的比较研究

应用白细胞介素-2(IL-2)依赖T细胞株(Cytotoxic T Lymphocyte line)检测 IL-2,~3H-TdR掺入法与四甲基偶氮唑(MTT)比色法的检测效果,两者有一定的一致性。~3H-TdR掺入法重复性较好。在IL-2活性单位的计算方法上,比较了直接作图法、直接回归分析及正概率分布法,并对这些方法进行了讨论。不论用何种方法统计分析,在检测样品 IL-2时用标化的 IL-2作对比是必需要的。

海藻硫酸多糖911对小鼠脾淋巴细胞增殖反应及对细胞产生IL—2作用的影响

本文以~3H—TdR掺入法观察911对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响并用CTLL细胞检测了其对IL—2的作用。体外实验结果表明,911对小鼠脾淋巴细胞增殖反应有明显的增强作用,以0.5μg/ml的浓度效果最为明显,相对增殖指数RPI可达200％;体内实验则以5mg/kg体重ip,连续7d效果最好,相对增殖指数RPI可达176％;911用药组小鼠IL—2的产生量均高于对照组,以5mg/kg和10mg/kg效果最好。以上实验证明,这一多糖是一种有希望的新免疫调节药物。

对IL-4两种测活方法的比较及MTT法最适条件确定

目的建立一种稳定、灵敏的方法用于检测 IL - 4生物活性。方法比较人外周血 T淋巴细胞与 CTL L - 2 /IL - 4R细胞系对 rh IL - 4的增殖应答特点及 MTT法用于 rh IL - 4生物活性检测过程中的细胞浓度、细胞培养时间、MTT掺入浓度及时间等条件。结果两者均能对 rh IL - 4呈规律性增殖应答。 IL - 4活性测定时 ,人外周血 T淋巴细胞检测最低限为 8U /ml,CTL L - 2 /IL - 4R细胞系为 0 .73U /ml。确定了 MTT法用于 CTL L - 2 /IL - 4R细胞系检测 rh IL - 4生物活性时的最佳条件方案。结论就重复性和应答敏感性来说 ,CTL L - 2 /IL - 4R较之 T淋巴细胞更为优越 ,该细胞系可用于建立一种较灵敏而稳定的 IL -4测活方法。

一种高度敏感的改良的IL-1检测方法

采用CTLL-2检测IL-1诱导小鼠胸腺瘤细胞系EL_4产生IL-2活性,建立了一种间接检测IL-1的方法。通过对多种影响因素进行探讨,选择了较适的诱导血清浓度,细胞浓度,诱导时间和转移诱导上清稀释度,从而使检测IL-1的敏感性达10^(-3)～10^(-4)U/ml(2.5～25×10^(-4)Pg/ml,约为小鼠胸腺细胞检测方法的10~2～10~3倍),整个检测流程可在40小时内完成。若用CTLL-2和EL_4细胞同时培养的一步法检测,敏感性约为10^(-1)U/ml,但30小时内可完成检测。此法不受高浓度rHuTNF-α、rHuTNF-β、rHuIL-6干扰,IL-2、ConA、PHA、LPS和SEB对检测系统只有较弱的影响,但A23187可明显地干扰检测系统。因此,本方法可用于基础和临床研究过程中不同来源的IL-1生物学活性检测。

淋巴因子相应靶细胞的小剂量辐射效应

观察了单次小剂量Ｘ射线全身照射后Ｃ５７ＢＬ／６小鼠胸腺细胞ＩＬ－１反应性和脾细胞ＩＬ－２反应性的变化。发现在１００ｍＧｙ以内的小剂量照射后，整个胸腺和脾脏的细胞数趋于增多，胸腺细胞对ＩＬ－１的反应性和牌细胞对ＩＬ－２的反应性趋于增强，体外照射ＩＬ－２依赖株ＣＴＬＬ－２细胞亦出现同样的反应趋势，但统计学处理与对照组比较均无明显差异。

用CTLL—2细胞测定白细胞介素—2的实验观察

我们探讨了CTLL－2细胞的增殖特性，倍增周期，传代时间以及各种来 源IL－2饲养CTLL－2的条件，在此基础上进一步探讨了^H-TdR参入，^125I-UdR参入和MTT酶显色反应等方法在测定CTLL－2细胞对IL－2的增殖反应中的优缺点，同时建立了CTLL－2细胞冻存方法和其它IL－2反应细胞测定IL－2的方法以弥补CTLL－2细胞饲养中的困难，对IL－2活性测定中的单位计算方法进行了探讨。

白介素-15突变体在大肠杆菌中的克隆表达及鉴定

目的 :构建两株IL 15末端缺失突变体以研究其N、C端对其功能的影响。方法 :以pBV2 2 0为载体 ,在大肠杆菌中进行表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经过SDS PAGE纯化 ,复性 ,以CTLL 2增殖实验检测野生型及突变体的生物活性。结果 :N端缺失突变体失去了增殖活性 ,而C端缺失突变体保持了对CTLL