狂犬病毒CTN-1v株毒种的不良反应与免疫学效果研究

目的 观察CTN - 1v株毒种的不良反应及免疫学效果。方法 选择 2 0例健康者接种应用CTN - 1v株毒种制备的狂犬病疫苗 ,观察接种者的不良反应进行中和抗体测定。结果 接种者的不良反应率为 35 % (7/ 2 0 ) ,中和抗体阳转率为 10 0 % ,免疫后 14天中和抗体水平平均为 13 0 8IU/ml(5 83～ 2 2 16IU/m1)。结论 CTN - 1v株毒种 ,不良反应轻微而且免疫原性良好 。

3种传代细胞系对狂犬病病毒CTN-1V株敏感性的比较

目的比较3种传代细胞系(Vero细胞、BHK-21细胞、MDCK细胞)对狂犬病病毒CTN-1V株的敏感性。方法采用混种的方法,将狂犬病病毒CTN-1V株分别接种于上述3种不同来源的连续传代细胞系,在不同时间观察3种细胞的病变情况,同时应用快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)和ELISA法检测病毒滴度和抗原含量,分析不同来源细胞对狂犬病病毒CTN-1V株的敏感性。结果Vero细胞培养的狂犬病病毒滴度在第8天达到高峰,为7.80LogFFD50/ml,BHK-21细胞病毒滴度在第6天达到高峰,为7.30LogFFD50/ml,而MDCK细胞在第6天病毒最高滴度只有5.55LogFFD50/ml。BHK-21细胞培养的狂犬病病毒抗原含量(A492)值,在各代次均高于Vero细胞和MDCK细胞。结论Vero细胞和BHK-21细胞对狂犬病病毒CTN-1V株的敏感性高于MDCK细胞,且BHK-21细胞产毒高峰比Vero细胞提前。

狂犬病病毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株的适应传代

目的：建立狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的传代适应株。方法用狂犬病病毒固定毒CTN-1V株经昆明小鼠鼠脑回传后的病毒接种Walvax-2细胞，连续传代，检测各代次病毒的滴度及免疫原性。结果CTN-1V株能较好地适应Walvax-2细胞，通过连续带毒传代至第7代，病毒滴度可达6．78lgLD50/mL，并在第10～15代内滴度维持在7．0lgLD50/mL以上，15～30代滴度稳定在7．0lgLD50/mL左右。以15代适应毒株CTN-1V-HDCP15制备的疫苗原液，各项指标均符合《中华人民共和国药典》三部（2010版）的要求，疫苗效力在6．0IU/剂以上。结论所获人胚肺二倍体细胞Walvax-2株传代适应狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC可用于人用狂犬病疫苗的生产开发。

国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在健康人群中的安全性及免疫原性

目的评价国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在10~60岁健康人群中的安全性和免疫原性。方法采用随机、盲法、同类制品平行对照的设计,将900名受试者按2∶1随机配对分别接种试验疫苗及对照疫苗,观察安全性;所有受试者于首剂免前和免后14及45 d采集静脉血,通过快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)测定血清中狂犬病病毒中和抗体滴度,计算几何平均浓度水平(GMC)。结果试验组与对照组不良反应发生率分别为32.33%和38.67%,试验组明显低于对照组(P<0.05)。局部反应主要为接种部位疼痛、发红、肿胀、瘙痒,全身反应主要为发热、头痛、乏力等,大部分为轻度(1级)。免后14、45 d试验组的狂犬病病毒中和抗体阳转率均为100.00%,抗体GMC分别为9.96和28.83 IU/m L,且与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)具有良好的安全性和免疫原性。

狂犬病病毒CTN-1V株糖蛋白遗传稳定性研究分析

目的测定6代次CTN-1V株病毒糖蛋白基因组序列，并研究其致病力稳定性。方法RT-PCR方法扩增6代次CTN-1V株病毒糖蛋白基因组序列，分别将产物克隆入pGEM-T载体中，测定并拼接序列，应用DNAStar和Mega4．0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析，并与近期我国分离且具有地域代表性的狂犬病病毒街毒株进行基因同源性分析；测定6代次CTN-1V株病毒滴度（LD卯／m1）和细胞荧光滴度（FFU／m1），采用FFU／LD∞指标来对病毒的毒力进行评价。结果6代次CTN-1V株病毒序列测定结果表明，仅第1222位的G突变为A，导致408位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸，而1320位核苷酸由A突变为G，但显示为无义突变；5代次CTN-1V株病毒致病力指标均在1．00～1．07之间；糖蛋白生物信息学分析表明，CTN-1V株病毒与我国近期分离的街毒株均具有较高同源性。结论CTN-1V株病毒糖蛋白传代稳定，且与我国近期分离的街毒株高度同源，各代次CTN-1V株病毒糖蛋白基因组序列的测定及致病力研究，为完善该毒株的质量控制提供数据支持。

狂犬CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的病毒收获液制备工艺研究

采用狂犬病病毒株CTN-1V株接毒于人二倍体细胞Walvax-2株进行病毒收获液制备工艺研究。接毒时,采用不同的人二倍体细胞量、不同的接毒方式及不同的moi进行比较;接毒后,待带毒细胞长至致密单层即95%以上,采用直接换病毒维持液和带毒传一代后再换维持液的方式进行比较;同时采用不同培养基维持液、不同pH值的维持液及对不同的病毒收获时间进行比较;通过测定病毒收获液的滴度来确定狂犬病病毒株CTN-1V株接毒于人二倍体细胞Walvax-2株上的病毒收获液最适制备工艺条件。接毒时,采用人二倍体细胞量≥2亿,37℃悬浮混合吸附30 min的方式及0.05 moi;接毒后采用美迪DMEM+0.3%人血白蛋白作为病毒维持液、pH为7.8~8.0的维持液及从换维持液d 3开始收获病毒液,并换上新的维持液,之后再进行5 d及7 d病毒液的收获,通过动物法和细胞法测定收获液的病毒滴度,3次收获液的病毒滴度均大于7.0 lg LD50/m L。建立起了稳定的狂犬病病毒株CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的病毒收获液制备工艺。

无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立

目的建立无血清培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株的工艺。方法分别采用VP-SFM和含5%牛血清DMEM于方瓶中培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株,比较无血清培养基培养不同代次Vero细胞间及无血清与含血清培养基培养Vero细胞间制备的狂犬病病毒滴度及效力。将2 g/L微载体cytodex-1加至250 ml spinner flask中,加入Vero细胞,37℃培养3 d,按MOI=0.02接种狂犬病病毒CTN-1V株,检测病毒收获液的病毒滴度及效力,每天显微镜下观察细胞生长情况,计算细胞比生长速率。结果无血清培养基培养不同代次Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度和效力差异无统计学意义(P>0.05);无血清和含血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度差异无统计学意义(P>0.05),但无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒效力明显高于含血清的培养基(P<0.05)。搅拌瓶微载体系统培养Vero细胞制备狂犬病病毒,细胞贴壁均匀,生长良好,收获病毒液的平均病毒滴度为6.50 lg FFU/ml,平均病毒效力为6.77 IU/ml。结论初步建立了微载体系统无血清培养Vero细胞制备狂犬病病毒的工艺,为无血清规模化制备狂犬病疫苗奠定了基础。

我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析

目的测定我国人用狂犬病疫苗株4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白G基因序列,并对其进行生物信息学分析。方法 RT-PCR扩增3株病毒糖蛋白G基因,分别克隆至pGEM-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,进行测序。应用DNAstar MegAlign软件分析3株病毒糖蛋白的同源性,AntheProt 5.0及DNAstar Protean软件分析3株病毒糖蛋白的结构及潜在B细胞抗原表位的差异。结果 4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒均属基因Ⅰ型狂犬病病毒;其糖蛋白G区基因同源性为76.0%～88.4%,G区ORF基因同源性为84.4%～91.5%,氨基酸序列同源性为90.5%～92.2%;3株病毒糖蛋白前19位氨基酸中均存在潜在信号肽结构,其中第19位氨基酸为三者潜在信号肽断裂位点,第17位氨基酸为4aGV株病毒糖蛋白潜在信号肽断裂位点;3株病毒糖蛋白分别在第463～476、464～475及463～475位氨基酸存在潜在可折叠螺旋的疏水性区域,为明显跨膜区域;4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白氨基酸残基均富含潜在α螺旋、β折叠及卷曲结构,其比例分别为30%、31%、39%,28%、30%、41%和29%、30%、41%,易发生扭曲、折叠,形成丰富的二级结构;3株病毒糖蛋白潜在B细胞抗原表位位置与数量相似。结论已对3株人用狂犬病疫苗株G基因进行了全面生物信息学分析,为完善我国人用狂犬病疫苗生产用毒种的质控标准提供了支持。