CUL4A-DDB1细胞稳定株筛选及DNA双链断裂模型构建

目的为了鉴定并验证CUL4A-DDB1泛素连接酶复合体中参与DNA损伤修复反应过程的1～2种关键成分在损伤识别、早期及晚期修复中的动态变化,拟构建含有串联亲和纯化(TAP)标签载体并筛选高表达CUL4A/DDB1的细胞株,建立DNA双链断裂模型。方法利用PCR获得CUL4A/DDB1基因,构建重组表达载体pNTAP-A-CUL4A/DDB1;使用顺铂和电离辐射刺激等外界刺激建立合适的DNA双链断裂细胞模型,使用G418筛选稳定表达CUL4A/DDB1的细胞株。结果与结论成功构建pNTAP-A-CUL4A/DDB1表达载体,建立合适的DNA双链断裂细胞模型,筛选得到稳定表达CUL4A/DDB1的细胞稳定株,为下一步质谱分析CUL4A-DDB1泛素连接酶在DNA损伤修复过程中的新功能打下基础。

CUL4A促进人胃癌细胞增殖、侵袭和转移的机制

目的:探讨CUL4A基因在胃癌增殖、侵袭和转移中的机制。方法:siRNA干扰胃癌SCG-7901细胞中CUL4A基因的表达;CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;Transwell小室观察各组细胞的侵袭能力;Annexin-V-FITC/PI法检测各组细胞的凋亡情况,分析CUL4A对细胞凋亡的影响;Real time-PCR分析上皮间质转化(EMT)相关基因的表达情况。结果:siRNA有效干扰了胃癌SCG-7901细胞中CUL4A基因的表达(P<0.05);干扰CUL4A基因有效抑制了胃癌细胞的增殖(P<0.05);Transwell小室结果显示,干扰CUL4A基因阻碍了SCG-7901细胞的侵袭能力(P<0.05);细胞凋亡结果显示,干扰CUL4A基因促进了细胞的凋亡(P<0.05);Real time-PCR结果显示,干扰CUL4A基因后Snail mRNA和ZEB1 mRNA的表达降低(P<0.05),E-cadherin mRNA的表达升高(P<0.05)。结论 :CUL4 A基因促进胃癌细胞的增殖,抑制凋亡和侵袭,且影响了EMT相关基因的表达。

结直肠癌组织中miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白的表达变化及其意义

目的观察结直肠癌(CRC)组织中miR-138-5p、miR-876-5p、DNA损伤结合蛋白1和CUL4相关因子7(DCAF7)蛋白的表达变化,并探讨其临床意义。方法CRC患者98例,均接受手术治疗,术中留取CRC组织和癌旁组织,采用Real-time PCR法检测CRC组织和癌旁组织中miR-138-5p、miR-876-5p,采用蛋白印迹法检测CRC组织和癌旁组织中DCAF7蛋白,分析miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量与CRC患者临床病理参数的关系。以CRC组织中miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量的中位数为临界值,将CRC患者分为miR-138-5p高表达组和miR-138-5p低表达组、miR-876-5p高表达组和miR-876-5p低表达组、DCAF7蛋白高表达组和DCAF7蛋白低表达组,并分析miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量与CRC患者预后的关系。结果CRC组织中miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量分别为1.36±0.29、1.41±0.36、0.59±0.19,癌旁组织中miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量分别为2.15±0.48、2.08±0.44、0.20±0.08,两者相比,P均<0.05。miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量与CRC患者是否合并淋巴结转移、TNM分期、浸润深度有关(P均<0.05)。miR-138-5p低表达组3年总体生存率为67.3%,miR-138-5p高表达组3年总体生存率为86.6%,两组相比,P<0.05。miR-876-5p低表达组3年总体生存率为66.7%,miR-876-5p高表达组3年总体生存率为85.1%,两组相比,P<0.05。DCAF7蛋白高表达组3年总体生存率为67.2%,DCAF7蛋白低表达组3年总体生存率为87.5%,两组相比,P<0.05。结论CRC组织中miR-138-5p低表达、miR-876-5p低表达、DCAF7蛋白高表达,miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量与CRC患者是否合并淋巴结转移、TNM分期、浸润深度有关。与miR-138-5p高表达、miR-876-5p高表达、DCAF7蛋白低表达的CRC患者相比,miR-138-5p低表达、miR-876-5p低表达、DCAF7蛋白高表达的CRC患者术后3年总体生存率低。

番茄USP1响应干旱和高温胁迫的研究

DDB1作为CUL4泛素连接酶的核心组件参与细胞内许多重要的生命活动。前期研究发现番茄CUL4-DDB1复合物(CRL4)调节植物细胞的非生物胁迫应答。为进一步阐明DDB1在植物抗逆中的调控机制和生理功能,通过酵母双杂交筛选,发现普遍应激蛋白USP1与DDB1存在相互作用,USPs家族蛋白参与提高生物体对逆境胁迫的耐受;进一步研究发现USP1定位于细胞质中,且其基因表达受到多种胁迫条件诱导。此外泛素化实验揭示USP1可以被泛素化修饰降解,上调USP1表达导致植株对干旱和高温抗性的增强,表明USP1可能正调控番茄植株对逆境下胁迫的应答,且它的作用受CUL4-DDB1泛素连接酶的靶向降解调控。结果不仅揭示新的植物抗逆机理,而且为植物抗逆分子育种提供新的基因资源和技术途径。

CRL4B复合物抑制分泌型卷曲相关蛋白1促进胰腺癌的发生发展

目的探讨CRL4B复合物在胰腺癌发生发展中的作用及其分子机制。方法将胰腺癌细胞分为对照组(转染阴性对照慢病毒)、shCUL4B组(转染CUL4B慢病毒)、shDDB1组[转染DNA损伤结合蛋白1(DDB1)慢病毒]和shCUL4B+siSFRP1组[转染CUL4B慢病毒+分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)-siRNA]。对敲低CUL4B和DDB1的胰腺癌细胞系进行RNA测序(RNA-seq),寻找CRL4B复合物调控的靶基因,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测靶基因mRNA的表达,染色质免疫共沉淀(ChIP)-PCR实验鉴定CRL4B复合物直接调控的靶基因,Western blot法检测上皮-间充质转化(EMT)标志物蛋白的表达水平,EdU细胞增殖实验检测细胞增殖能力,划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。采用GEO、TCGA和GTEx数据库中胰腺癌相关肿瘤样本和正常组织样本的测序数据,分析CUL4B、DDB1和其下游靶基因的表达相关性。结果RNA-seq结果显示,CRL4B复合物调控的靶基因涉及多种恶性肿瘤相关信号通路。qRT-PCR检测结果显示,shCUL4B和shDDB1组待验证靶基因的mRNA表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。ChIP-PCR实验结果显示,CRL4B复合物直接结合在NME1和SFRP1靶基因启动子区,敲低CUL4B的表达后,靶基因启动子区域组蛋白H2A第119位赖氨酸单泛素化富集减少。对照组PANC-1细胞增殖率为(32.10±3.58)%,高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(13.95±1.66)%和(22.38±0.77)%,均P<0.05];对照组AsPC-1细胞增殖率为(35.47±7.80)%,高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(19.60±3.58)%和(30.09±0.81)%,均P<0.05]。细胞划痕实验显示,对照组PANC-1细胞迁移率为(53.18±3.70)%,高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(17.46±2.62)%和(44.99±9.18)%,均P<0.05]。Western blot结果显示,对照组细胞上皮标志物α-catenin和γ-catenin的表达分别为(1.00±0.03和1.01±0.11),低于shCUL4B组(分别为1.44±0.01和1.21±0.06,均P<0.05),对照组细胞间充质标志物Fibronectin和Vimentin表达水平分别为1.01±0.14和1.02±0.18,高于shCUL4B+siSFRP1组(分别为1.53±0.13和1.22±0.07,均P<0.05)。对照组细胞的迁移率为(100.00±3.96)%,与shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(35.49±0.34)%和(107.06±2.77)%]比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。CUL4B和DDB1在胰腺癌中表达升高,且与SFRP1的表达呈负相关(r分别为-0.342和-0.264)。结论胰腺癌中CRL4B复合物转录抑制靶基因SFRP1进而促进胰腺癌的发生发展,且CRL4B复合物在胰腺癌中的高表达支持了其作为胰腺癌治疗的潜在靶点。

番茄SlWD1基因的克隆及SlWD1与DDB1的相互作用

在真核生物中,CDT2作为一个WD40家族蛋白,是CUL4-DDB1 E3泛素连接酶复合体的重要组成部分.其主要功能是将CUL4-DDB1 E3泛素连接酶和靶向蛋白连接起来,从而实现靶蛋白的泛素化修饰.利用RT-PCR技术和3’RACE技术,本研究在番茄中克隆到一个与人类CDT2同源的基因,命名为SlWD1.通过对番茄SlWD1蛋白序列与其它模式生物的蛋白序列进行氨基酸保守结构域分析和同源性比对,发现SlWD1具有2个非常保守的WD40家族的DWD结构域.酵母双杂交和免疫共沉淀实验都证明,SlWD1与DDB1具有相互作用;实时定量RT-PCR分析证明,SlWD1基因在各个组织中都表达,为组成型表达,但是,在生殖器官中的表达量要明显比其它的组织高.

EZH2在恶性胸膜间皮瘤中的作用机制研究

[目的]探讨恶性胸膜间皮瘤中EZH2、Cul4A、Gli1的表达及其相互作用关系。[方法] Real-time PCR检测恶性间皮瘤细胞株H2452、MSTO-211H以及人正常间皮细胞株Met-5A中EZH2、Cul4A、Gli1 mRNA的表达量;上调或下调EZH2表达后检测Cul4A、Gli1 m RNA的表达变化;利用免疫组化技术检测恶性胸膜间皮瘤患者病理组织中EZH2、Cul4A、Gli1表达并分析其相关性。[结果] EZH2高表达的H2452细胞中,Gli1呈高表达,而Cul4A表达量与正常细胞无明显差异,抑制EZH2表达可使Gli1表达量下降,但对Cul4A表达无明显影响。EZH2低表达的MSTO-211H细胞中,Gli1呈低表达,导入外源性EZH2基因,可使Gli1表达升高,而Cul4A表达无明显改变。恶性胸膜间皮瘤标本中,EZH2表达阳性率为77.6%(52/67),Cul4A表达阳性率为76.1%(51/67),Gli1表达阳性率为65.7%(44/67),EZH2与Gli1表达呈正相关(r=0.815,P<0.05),EZH2与Cul4A表达无明显相关性(r=0.145,P>0.05),Cul4A与Gli1表达呈正相关(r=0.577,P<0.05)。[结论]恶性胸膜间皮瘤中EZH2、Cul4A、Gli1呈高表达,并且Gli1表达与EZH2表达存在相关性,可能为EZH2的下游调控基因。