雌牙鲆CYP19A基因启动子“CpG”岛区的单核苷酸多态性及与繁殖性能的关联分析

芳香化酶基因(CYP19)编码的芳香化酶是雄激素转化为雌激素的关键酶,在鱼类性腺发育及繁殖内分泌过程中起着重要的作用。本研究采用聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)和放射性免疫方法(RAI)对61尾雌牙鲆进行了CYP19A基因启动子CpG岛区多态性检测,并将其与繁殖性能进行了关联分析。CpG岛区存在3种类型的基因型(pattern1、pattern2、pattern3),经测序发现CpG岛区有以下突变:T-1927插入或缺失、C-1899插入或缺失、T-1772C、C-1766T、TGTCAAC-1752^-1744插入或缺失(11个SNPs连锁突变)。方差分析结果表明:此位点对雌二醇(E2)水平的效应达到显著(P<0.05)水平,经多重比较分析,具有pattern1基因型的个体的雌激素(E2)水平显著低于pattern2和pattern3基因型个体的雌激素水平(P<0.05),同时pattern1基因型的个体的mRNA表达量显著低于pattern2和pattern3基因型个体的mRNA表达量(P<0.05)。以上结果表明,CYP19A基因调控区甲基化位点突变可能导致芳香化酶的表达量,进而影响牙鲆繁殖内分泌过程;同时也阐明了这些与牙鲆繁殖性状相关的SNPs可以用于生产实践中进行标记辅助选择具有优良繁殖性能的牙鲆。

雌二醇和甲基睾酮暴露对食蚊鱼CYP19a表达的影响

探讨17β-雌二醇(E2)和17ɑ-甲基睾酮(MT)暴露对食蚊鱼(Gambusia affinis)CYP19a基因表达的影响。采用静水暴露方法,分别设置2、10、50、100 ng/L E2和MT各4个实验组,并设置对照组和平行组,定量测定第7,14,21,28 d性腺组织CYP19a mRNA表达水平的变化。E2暴露实验结果显示,初始相对较低浓度的E2(2、10 ng/L)对食蚊鱼CYP19a基因的表达起促进作用,而较高浓度的E2(50、100 ng/L)对CYP19a起抑制作用;随着暴露时间的延续,食蚊鱼CYP19a基因的表达受低浓度E2的影响不明显,而高浓度的E2则极明显上调食蚊鱼CYP19a基因的表达。MT暴露的实验结果显示,初始所有MT实验浓度组(2、10、50、100 ng/L)均对食蚊鱼CYP19a基因起促进作用;随着暴露时间的延长,较低浓度MT对食蚊鱼CYP19a基因产生的影响不明显,较高浓度的MT则显著性地抑制食蚊鱼CYP19a的表达。结果表明,两种典型环境激素对食蚊鱼CYP19a基因表达的影响十分显著,鱼类CYP19a基因mRNA表达适合作为环境激素污染的生物标志物。

翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的克隆及表达研究

采用同源克隆与SMART RACE技术首次分离和克隆了翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的c DNA全长,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)技术分析了其在翘嘴鳜成体不同组织及性腺不同发育时期的表达特点。序列分析结果显示,CYP19a基因全长1 873 bp(Gen Bank登录号为KX911988),其中开放阅读框长1 581 bp,编码526个氨基酸。通过多序列比对,发现该基因编码的蛋白质具有P450arom A特定的功能保守序列,包括I-螺旋区、Ozol肽区、亚铁血红素结合区域以及芳香化酶特异性结合区域;同时,CYP19a基因序列的同源性分析结果显示,其在脊椎动物中较为保守。此外,q PCR检测结果显示,CYP19a基因在翘嘴鳜成体组织中的表达存在显著差异(P<0.05),主要在性腺中表达,其次在脑和肝脏有少量表达;而且CYP19a基因在繁殖期性腺中的表达量显著低于非繁殖期性腺中的表达量(P<0.05)。以上研究表明,CYP19a基因在鱼类性腺形成及发育过程中具有重要作用。

饥饿对金鱼卵巢型和脑型芳香化酶基因表达的影响研究

采用RT-PCR技术,研究了金鱼性腺型芳香化酶基因(CYP19A)和脑型芳香化酶基因(CYP19B)的表达对饥饿胁迫的响应机制.研究结果表明:正常投喂的雌性金鱼中CYP19A基因mRNA在卵巢、肝脏、肾脏、肌肉、鳃、头肾、脾脏、脑、肠和心脏10个组织均有表达,表达量呈现递减趋势;饥饿胁迫后,CYP19A基因mRNA在脑和卵巢中表达的变化规律基本一致,即饥饿5d时表达量显著降低(P<0.05),随后表达水平维持稳定.正常投喂的雌性金鱼CYP19B基因mRNA在脑、头肾、性腺、脾、肌肉和心脏6个组织中表达呈现递减趋势;CYP19B基因mRNA在脑和卵巢中的表达量,在饥饿5d时表达量显著降低(P<0.05),随后表达水平维持稳定.这些结果说明,雌性金鱼在饥饿条件下,性激素合成关键酶基因在脑和卵巢中的表达量显著降低,可能影响卵巢发育。

暗纹东方鲀芳香化酶基因的结构及表达分析

性腺型芳香化酶基因是一种调节雌雄激素平衡的基因。为初步探究暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全长序列,共1786 bp,编码514个氨基酸,与红鳍东方鲀及星点东方鲀同源性最高。氨基酸序列分析显示,该基因编码的蛋白是一种稳定的亲水性蛋白,但不存在信号肽序列;性腺型芳香化酶含有38个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、2个跨膜保守结构域;其氨基酸序列在哺乳动物和鱼类中均十分保守,且含有跨膜区、Ⅰ-螺旋区、Ozol′s肽区、芳香化酶特异性保守区和亚铁血红素结合区等功能保守区。表达分析显示,暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达,而且在幼鱼不同发育期卵巢中的表达量呈现出逐渐升高再降低的表达趋势,在精巢中则基本不表达。研究结果表明,性腺型芳香化酶基因很可能参与了暗纹东方鲀雌鱼性腺分化后卵巢的发育、雌性特征的维持和其他组织的发育等过程。

鱼类两种缓释催产激素载体临床性能的比较研究

采用组织切片技术和RT-PCR技术研究了海藻酸钠微球和壳聚糖微球作为缓释激素载体在临床上对金鱼基础生物学指标以及CYP19A、GH基因mRNA表达的影响,以检测两种缓释激素载体对鱼类生殖和生长的影响。研究结果表明:缓释材料埋植0、7、14、30、48d后,雌性和雄性金鱼处理组与对照组(埋植0.7%生理盐水组)比较,海藻酸钠微球埋植组和壳聚糖微球埋植组在基础生物学方面没有出现显著性差异;不同处理组中实验鱼性腺组织切片卵巢和精巢的发育均处于同一时期(按照Мейен分期原则);海藻酸钠微球埋植组和壳聚糖微球埋植组中,各次采样组的CYP19A基因表达均没有出现明显性差异;海藻酸钠微球埋植组GH基因各次取样时间均未出现显著性差异,雌性金鱼壳聚糖微粒埋植组GH基因的表达在0、7、14、30采样后显著上升(P<0.05),埋植48d差异消失,雄性金鱼壳聚糖埋植组未出现明显差异。综合显示:作为缓释载体,海藻酸钠微球在临床上的性能较壳聚糖微球更为稳定,而壳聚糖微球对雌性金鱼的GH基因mRNA表达的促进作用更为明显。