淡色库蚊细胞色素P450 CYP4E2r6基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并表达鉴定淡色库蚊细胞色素P450(CYP4E2r6)基因。方法根据昆虫细胞色素P450氨基酸保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR,从淡色库蚊四龄幼虫mRNA中扩增出目的基因片段。产物经T-A克隆、测序、比对,在抗性品系高表达的CYP4E2r6亚克隆入原核表达载体pGEX-6P1,在大肠杆菌BL21中进行原核表达,将细菌总蛋白进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果14个阳性克隆中9个为CYP4新序列,由GenBank登录上网(GenBank/NCBICB074944-51、CB270837,2003年);经鉴定属CYP4家族CYP4H、CYP4E、CYP4J亚家族;CYP4E2r6基因已成功表达。结论获得的CYP4E2r6融合表达蛋白为进一步研究CYP4基因与抗药性之间的关系奠定基础。

淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4E2r6基因的克隆与生物信息学分析

目的从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫扩增并分析CYP4E2r6基因,为蚊虫抗药性的研究、检测和防治筛选靶标。方法根据已扩增的CYP4E2r6基因片段(长470bp,GenBank登录号为CB074945)的序列设计2条特异引物,从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫提取RNA,反转录成cDNA,以cDNA为模板,用5′-RACE和3′-RACE方法,各获得722bp、617bp片段。进行序列拼接并对所得新基因进行登录和生物信息学分析。结果获得了1条3′端含polyA尾,长1025bp的CYP4E2r6基因大片段(GenBank登录号为AY309972),编码289个氨基酸,与果蝇细胞色素P450氨基酸的同源性为55%。编码蛋白的理论分子质量单位为32.9ku,等电点为5.8。结论获得了CYP4E2r6基因大片段,为进一步获取全长基因并研究该基因的功能奠定了基础。