CacyBP/SIP对子宫内膜异位症间质细胞侵袭、迁移及血管生成的影响

目的探讨钙周期素结合蛋白(Calcyclin-Binding Protein/Siah-1-Interacting Protein,CacyBP/SIP)对子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)间质细胞侵袭、迁移及血管生成的作用机制。方法选取2021年1月至2022年12月在石家庄市妇幼保健院产科就诊的60例EMs患者为研究对象,经腹腔镜手术,取子宫内膜组织并分离子宫内膜间质细胞。使用重组CacyBP/SIP慢病毒、抑制剂转染细胞之后检测病毒、抑制剂转染结果,实验分为5组,分别为CacyBP/SIP慢病毒组、慢病毒阴性对照组、CacyBP/SIP抑制剂组、抑制剂阴性对照组及未治疗组。定量PCR鉴定各组细胞CacyBP/SIP水平,Transwell法检测各组细胞侵袭、迁移,MTT比色法检测各组细胞增殖,流式细胞仪检测各组细胞凋亡,免疫印迹法检测各组细胞血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)表达水平。结果与抑制剂阴性对照组比较,CacyBP/SIP慢病毒组24、48、72 h细胞增殖升高(P<0.05),与CacyBP/SIP慢病毒组比较,CacyBP/SIP抑制剂组的细胞增殖降低(P<0.05);与抑制剂阴性对照组比较,CacyBP/SIP慢病毒组CacyBP/SIP水平、细胞侵袭数量、迁移数量及VEGF、COX-2蛋白表达升高(P<0.05),与CacyBP/SIP慢病毒组比较,CacyBP/SIP抑制剂组的上述指标降低(P<0.05);未治疗组、慢病毒阴性对照组、抑制剂阴性对照组、CacyBP/SIP慢病毒组、CacyBP/SIP抑制剂组细胞凋亡率分别为8.54%±0.26%、8.42%±0.38%、8.46%±0.19%、3.38%±0.15%、18.42%±1.23%,与抑制剂阴性对照组比较,CacyBP/SIP慢病毒组细胞凋亡率降低(P<0.05),与CacyBP/SIP慢病毒组比较,CacyBP/SIP抑制剂组细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论CacyBP/SIP的低表达可降低EMs间质细胞的增殖、侵袭及迁移能力,推测其通过抑制VEGF、COX-2基因,可抑制血管生成。

二氯化钴致人结肠癌细胞系CacyBP/SIP核转位

目的观察和探讨低氧可否引起人结肠癌细胞系CacyBP/SIP核转位。方法用人结肠癌细胞系HCT-116的cDNA序列,用分子克隆法构建过表达CacyBP/SIP的绿荧光慢病毒载体,转染至结肠癌SW480细胞,用CoCl2作为刺激因子,激光共聚焦显微镜和Western blot检测CacyBP/SIP的表达及定位。结果构建了过表达CacyBP/SIP的慢病毒载体,转染至结肠癌细胞,CoCl2刺激前CacyBP/SIP定位和表达主要在细胞胞质,刺激后CacyBP/SIP定位和表达在细胞胞质和胞核。结论 CoCl2刺激后可致CacyBP/SIP核转位。

结肠癌细胞中CacyBP/SIP的表达及核转位现象

目的:拟明确CacyBP/SIP在结肠癌细胞中的表达及定位,探讨CacyBP/SIP在结肠癌发生发展中的意义.方法:采用Westernblot对3种结肠癌细胞系中CacyBP/SIP的表达进行检测;间接免疫荧光细胞内染色检测CacyBP/SIP在结肠癌细胞中的定位以及给予KC1、胃泌素(10-8mol/L)刺激后CacyBP/SIP的定位;激光共聚焦检测胃泌素刺激后结肠癌细胞中Ca2+浓度的变化.结果:HT29及SW480结肠癌细胞中均表达CacyBP/SIP,Lovo细胞中未检测出CacyBP/SIP.间接免疫荧光显示CacyBP/SIP主要位于结肠癌细胞的胞质中,给予KC1刺激后CacyBP/SIP转位至细胞核,洗脱KC1后,CacyBP/SIP位于胞质;给予胃泌素刺激后亦可观察到CacyBP/SIP转位至细胞核;与无胃泌素刺激的细胞相比,给予胃泌素刺激的细胞内Ca2+浓度显著高于对照组f25.33±0.57vs21±1,P<0.05).结论:CacyBP/SIP在结肠癌细胞中表达,且主要定位于胞质,当细胞内Ca2+浓度升高后转位至细胞核,提示CacyBP/SIP可能通过入核来参与结肠癌的发生发展.

CacyBP/SIP基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的观察干扰小RNA(siRNA)介导的Cacy BP/SIP基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响。方法化学合成Cacy BP/SIP基因序列特异性siRNA(Cacy BP/SIP siRNA),采用脂质体法转染siRNA至MDA-MB-231细胞(Cacy BP/SIP siRNA组),MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率。Realtime PCR和Western blotting检测MDA-MB-231细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白的表达。另设阴性对照组和空白对照组。结果与阴性对照组和空白对照组比较,Cacy BP/SIP siRNA组MDA-MB-231细胞增殖能力显著下降(P<0.05),细胞凋亡率显著增高(P<0.05)。Caspase-3和Bax mRNA及蛋白表达上调(P<0.05),Bcl-2 mRNA及蛋白表达下调(P<0.05)。结论靶向沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中Cacy BP/SIP基因表达后,可以抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡,其作用可能通过下调Bcl-2表达,上调Caspase-3和Bax表达发挥诱导细胞凋亡的作用。

前列腺素E_2对结肠癌细胞CacyBP/SIP核转位的影响

目的用前列腺素E2刺激结肠癌细胞,观察和探讨可否引起CacyBP/SIP核转位。方法根据hCacyBP/SIP序列设计引物,PCR扩增、酶切、连接、转化等分子克隆法构建含有钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)的慢病毒重组质粒,PCR鉴定、测序;将构建好的带有绿荧光蛋白的CacyBP-Lentivirus载体转染至结肠癌SW480细胞,用激光共聚焦显微镜检测CacyBP/SIP表达定位;前列腺素E2刺激后激光共聚焦显微镜、Western blot观察CacyBP/SIP在细胞中的定位。结果激光共聚焦和Westernblot发现:前列腺素E2刺激前CacyBP/SIP定位和表达主要在细胞胞质,用100μmol/L前列腺素E2刺激1h,CacyBP/SIP定位和表达在细胞胞质和胞核。结论前列腺素E2刺激可以引起CacyBP/SIP由胞质转位至细胞核。

CacyBP/SIP基因siRNA的筛选

目的探讨靶向钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)基因的3对小干扰RNAs(small interference RNA,siRNAs)转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231后,能否抑制CacyBP/SIP基因的表达。方法化学合成3对CacyBP/SIP特异性siRNA(CacyBP/SIP-siRNA),分别转染MDA-MB-231细胞,RT-PCR法、Western blotting方法分别检测转染前后MDA-MB-231细胞的CacyBP/SIPmRNA和蛋白的水平。结果 CacyBP/SIP-siRNA001成功转染入人乳腺癌MDA-MB-231细胞,RT-PCR结果显示,siRNA001组CacyBP/SIP mRNA的表达量为NC-siRNA阴性对照组的(25.2±1.34)%,siRNA002和siRNA003则为(64.8±0.58)%和(77.5±1.27)%,CacyBP/SIP-siRNA001转染后能够抑制MDA-MB-231细胞中CacyBP/SIPmRNA,沉默效率为(74.8±0.75)%(P<0.05),Western blotting证实了siRNA001的沉默作用。结论 CacyBP/SIP-siRNA001能显著沉默MDA-MB-231细胞中CacyBP/SIP mRNA和蛋白的表达。

人结肠癌细胞中CacyBP/SIP核转位差异表达基因的验证

目的验证细胞周期聚合酶链反应(PCR)芯片筛选出来的差异表达基因。方法胃泌素刺激的SW480细胞作为实验组,无胃泌素刺激的SW480细胞作为对照组。用蛋白免疫印迹(Western blot)法对胃泌素刺激前后的钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)表达定位进行检测;用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对细胞周期PCR芯片筛选出的差异表达基因周期素依赖性蛋白激酶8(CDK8)和细胞周期蛋白依赖性激酶亚基2(CKS2)进行验证。结果胃泌素刺激前CacyBP/SIP主要表达于细胞质,刺激后可同时表达于细胞质和细胞核;同细胞周期PCR芯片结果一致,基因CDK8和CKS2在实验组的表达量较对照组明显上调(P<0.05)。结论胃泌素刺激可使CacyBP/SIP发生核转位;基因芯片筛选出的差异基因大体可靠,对筛选出的差异基因可以进行进一步研究。

CacyBP/SIP在不同大肠组织中的表达及临床意义

目的:检测钙周期素结合蛋白[calcyclin(S100-A6)-binding-protein,CacyBP/Siah-1 interactingprotein,SIP]在大肠各种组织中的表达,探讨其在大肠癌发生发展中的作用.方法:采用免疫组织化学技术检测10例正常大肠组织、17例大肠增生性息肉、26例大肠腺瘤和50例大肠癌组织中CacyBP/SIP的表达.采用Western blot检测3例大肠癌及相应癌旁正常组织中CacyBP/SIP的表达.并分析CacyBP/SIP与大肠癌临床病理资料之间的关系.结果:CacyBP/SIP在正常大肠、大肠增生性息肉、大肠腺瘤及大肠癌组织中的表达率分别为0(0/10)、17.7%(3/17)、26.9%(7/26)、52.0%(26/50),CacyBP/SIP在大肠增生性息肉中的表达与正常大肠组织中的表达比较无统计学差异(P>0.05),而在大肠腺瘤组织、大肠癌组织中的表达与正常大肠组织比较差异均有统计学意义(P<0.05).Western blot显示CacyBP/SIP在大肠癌组织中的表达明显高于其相应癌旁正常组织,差异有统计学意义(P<0.05).CacyBP/SIP在大肠癌组织中的表达与大肠癌患者的性别、年龄、组织分化程度、TNM分期之间比较均无统计学差异(P>0.05).结论:CacyBP/SIP在大肠腺瘤组织、大肠癌组织中高表达,可能参与了大肠癌的发生发展.

表皮生长因子对CacyBP/SIP过表达慢病毒载体转染的结肠癌细胞CacyBP/SIP核转位的影响

目的观察和探讨表皮生长因子对钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)过表达慢病毒载体转染结肠癌细胞CacyBP/SIP核转位的影响。方法构建含有CacyBP/SIP的慢病毒重组质粒并转染至结肠癌SW480细胞。采用激光共聚焦显微镜及Western blot法观察100 ng/mL表皮生长因子刺激前后CacyBP/SIP蛋白在胞质、胞核中的定位及表达变化。结果激光共聚焦和Western blot检测结果发现,表皮生长因子刺激前CacyBP/SIP均主要定位和表达于细胞质,刺激1 h后CacyBP/SIP定位和表达于细胞胞质和胞核。结论表皮生长因子刺激过表达CacyBP/SIP慢病毒载体转染的结肠癌细胞可引起CacyBP/SIP由胞质转位至细胞核。

稳定敲除CACYBP/SIP基因的MCF-7细胞株的构建及其细胞增殖的变化

目的利用CRISPR/Cas9系统构建CACYBP-/-乳腺癌MCF-7基因缺陷细胞株,并研究该基因敲除株对细胞增殖能力的影响。方法设计特异sgRNA序列,构建Lenti-CAS9-sgRNA-puro质粒,转染MCF-7细胞,puromycin抗性筛选,Cruiser检测sgRNA活性,极限稀释法筛选单克隆株,Western blot检测CACYBP/SIP蛋白的表达,Brdu和MTT试剂盒检测CACYBP/SIP缺失后细胞增殖能力。结果成功构建Lenti-CAS9-sgRNA-puro质粒,puromycin最佳筛选浓度为0.9μg/mL,sgRNA1活性最高,获得的单克隆系测序唯一敲除CACYBP/SIP的MCF-7细胞株增殖能力减弱(P<0.05)。结论敲除CACYBP/SIP的MCF-7细胞株增殖能力减弱。

Deletion of Salmonella enterica serovar typhimurium sipC gene

Objective:To construct a novel plasmid as Salmonella enterica serovar typhimurium(S.typhimurium)sip C gene knockouts candidate.Methods:In this research,50upstream and 30downstream regions of S.typhimurium sip C gene and kanamycin gene were PCR amplified.Each of these DNA fragment was cloned into p GEM T-easy vector.The construct was confirmed by PCR and restriction digest.Results:PCR amplified 320,206 and 835 bp DNA fragments were subcloned into p ET-32 vector resulting with a plasmid called p ET-32-sip C up-kan-sip C down.Conclusions:The new plasmid(p ET-32-sip C up-kan-sip C down)is useful for genetic engineering and for future manipulation of S.typhimurium sip C gene.

牛源无乳链球菌sip蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为测定牛源无乳链球菌表面免疫相关蛋白(sip)的抗原性,本实验通过建立间接ELISA方法,对该蛋白的抗原性进行分析及鉴定。根据无乳链球菌sip基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板,PCR扩增sip抗原表位优势区编码的基因序列,并将其与原核表达载体pET-30a(+)连接,构建重组质粒pET-sip,转化宿主菌BL21中,经IPTG诱导,获得重组蛋白,western blot分析表明,重组蛋白具有良好的抗原性。以纯化的表达产物作为包被抗原,建立检测无乳链球菌抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.125μg/mL,血清最佳稀释度为1∶160,酶标二抗最适稀释度为1∶4 000。应用该方法对无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌兔阳性血清进行检测,结果表明,该方法具有良好的特异性和灵敏度。

罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)Sip基因的克隆、鉴定及分子特性分析

利用设计的特异性引物,扩增出了分离自患病罗非鱼无乳链球菌强毒株Sip基因,并将其克隆到pMD19-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切(BamHⅠ+HindⅢ)鉴定,并利用多种生物信息学软件对Sip基因进行分子特性分析。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌Sip编码氨基酸序列具有极高保守性,与人源、哺乳动物源无乳链球菌亲缘性达100%,存在1个由25个氨基酸组成的信号肽,具有1个与免疫调节功能相关的LysM结构域,具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点33个和N-糖基化位点2个,编码多肽链中疏水区大于亲水区,是一种膜外蛋白。密码子偏爱性分析表明,罗非鱼源无乳链球菌Sip基因密码子使用频率差异较大,密码子偏爱性与真核生物较为接近。

Bt菌株DQ89的sip基因的克隆、表达及杀虫活性分析

苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringicnsis(Bt)是一种广泛存在于自然界中的生防微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的内毒素(insecticidal crystal proteins,ICPs)、营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,VIP)和分泌期杀虫蛋白(secreted insecticidal protein,Sip),相比于以上2种杀虫蛋白,Sip的研究相对较少。本研究从实验室中的Bt野生菌株中克隆sip基因,其中编号为DQ89的Bt菌株成功克隆得到1188 bp大小的sip基因,编码395个氨基酸,与已知的Sip1A蛋白的相似性为87%,序列提交到Gen Bank并获得登录号KP114614。将该基因在大肠杆菌中表达的蛋白进行生物活性测定,结果显示其对大猿叶甲Colaphellus bowringi Baly具有一定的杀虫活性,其LC50为1.542μg/m L。

奶牛乳房炎无乳链球菌Fc-Sip和金黄色葡萄球菌Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗的免疫试验研究

为探究由IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌(S.agalactiae,Sgc)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sau)保护性抗原亚单位疫苗的免疫效果,在本实验室前期研究基础上,本研究按体积11的比例将Sgc的Fc-Sip和Sau的Fc-FnBPB-ClfA两种蛋白分别与1%的盐酸左旋咪唑(1%LH)充分混合,制备两种亚单位疫苗。将即将干奶(妊娠220 d)、CMT试验为"++"以上的奶牛随机分为4组,分别将Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA二联亚单位疫苗(A组)、Fc-Sip亚单位疫苗(B组)、Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗(C组)通过首次肌肉免疫和二次乳头管灌注免疫方式进行免疫试验。通过免疫前后对乳样细菌分离、体细胞数测定及免疫血清抗体滴度测定,评价上述亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前免疫组(A、B、C)奶牛的乳样细菌分离率分别为80%、90%、80%,其中Sgc检出率分别为20%、30%、10%,Sau检出率分别为30%、20%、10%;首免90 d后3个免疫组奶牛乳样细菌分离率分别降至20%、20%、40%,其中Sgc的检出率分别降至0、0、10%,Sau的检出率分别降至10%、10%、0,对照组免疫前后以上各项检测无明显变化。使用利拉伐牛奶体细胞检测仪检测免疫前后试验奶牛乳样中的体细胞数,免疫前免疫组(A、B、C)奶牛体细胞数均值分别为6.19×105个/mL、5.16×105个/mL、5.49×105个/mL,首免90 d后3个免疫组奶牛乳样中体细胞数均值分别为2.05×105个/mL、2.04×105个/mL、2.52×105个/mL,而对照组奶牛乳样体细胞数与免疫前无明显变化。检测首免后0、7 d、14 d、28 d、60 d、90 d的血清抗体滴度,结果显示,首免后7 d,免疫组(A、B、C)80%的奶牛血清抗体滴度为11024;第14 d后,免疫组(A、B、C)90%奶牛血清抗体滴度达到12048;第28 d后,免疫组(A、B、C)80%奶牛血清抗体滴度在14096~18192,比对照组平均上升3~4个抗体滴度,对照组奶牛血清抗体滴度一直保持在1256~1512。综合分析以上试验结果显示免疫A组(Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA)综合免疫效果在各免疫组中最佳。本研究结果表明Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA二联亚单位疫苗对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎具有较好的治疗和预防作用,为奶牛隐形乳房炎的防治提供了实验依据。

IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌保护性抗原Sip亚单位疫苗的研究

为研究无乳链球菌Fc-Sip亚单位疫苗的免疫效果,并验证IgGFcRn在奶牛乳腺发生局部免疫过程中的重要作用。本研究采用大肠杆菌原核表达系统,表达了由IgGFcRn介导无乳链球菌保护性表面抗原蛋白(Sip)的融合蛋白Fc-Sip,并与佐剂混合制成Fc-Sip亚单位疫苗。选取干奶前15 d的奶牛进行加州乳房炎检测法(CMT)检测,选取120头CMT(++)以上的奶牛进行分组免疫。通过免疫前后的细菌分离试验、牛奶体细胞数测定、免疫牛血清抗体间接ELISA检测来评价该亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前乳样细菌分菌率为86.6%,无乳链球菌检出率为46.6%;免疫后乳样分菌率降至40%,无乳链球菌检出率降至13.3%,表明Fc-Sip亚单位疫苗不但可以治疗无乳链球菌性奶牛乳房炎,还可以抑制其它奶牛乳房炎致病菌的侵入。首次免疫后60 d,免疫组80%奶牛血清抗体滴度达到1∶2 048～1∶4 096,对照组奶牛抗体滴度一直保持在1∶512。首次免疫后90 d,使用利拉伐牛奶体细胞计数仪测定实验奶牛乳样中的体细胞数,免疫组奶牛乳样体细胞数范围在0.17×10~5个/mL～3.91×10~5个/mL,对照组奶牛乳样体细胞数的范围在4.05×10~5个/mL～7.27×10~5个/mL。免疫组奶牛血清抗体滴度的升高及免疫后牛奶中体细胞数的减少,表明该亚单位疫苗促进了奶牛体液免疫反应和局部免疫反应的发生,也证明该亚单位疫苗具有降低牛奶体细胞数的作用。本研究为奶牛乳房炎无乳链球菌疫苗的研制奠定了基础。

吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达

利用重叠延伸(SOEing)PCR技术,将吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0910株表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因通过Linker序列融合,构建成为Sip-GAPDH融合基因。将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明,重组质粒pET-32a-Sip-GAPDH在大肠杆菌BL21(DE3)中表达后所获得的融合蛋白Sip-GAPDH分子量为102.01 kD,表达最佳条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导5 h。Western blot鉴定结果表明融合基因得到了成功表达。

无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗的制备及免疫效果评价

为了研究无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗对罗非鱼链球菌病的免疫保护作用,本研究通过PCR和重叠延伸拼接技术(SOEing)获得融合基因Sip-GAPDH,连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)制备DNA疫苗,通过背鳍肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼,免疫后第7、28天取样,采用PCR及RT-PCR方法检测pcDNA-Sip-GAPDH在各个组织(包括肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏)中的表达情况。采用ELISA、Real-time PCR法和体外攻毒法分别分析各实验组不同时间血清抗体效价、免疫基因(IgM、IL-1β和CD8)表达变化规律和相对保护率,研究该嵌合性疫苗对吉富罗非鱼的保护效果。结果显示,实验组在免疫接种第7和第28天时,注射点周围的肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏均能检测到嵌合性质粒,实验组罗非鱼血清抗体效价均高于对照组并于21 d时达到峰值(1∶4 096);qPCR数据表明,实验组鱼体胸腺、头肾和脾脏的IgM、IL-1β和CD8基因的mRNA表达量均出现了上调,并且在胸腺、头肾和脾脏中的表达量分别在免疫后第12和第48 h达到峰值;免疫后42 d进行人工攻毒后计算免疫保护率为93.3%。以上研究结果表明,本研究构建的无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗在罗非鱼链球菌病防治中具有潜在的应用价值。

Ⅰa型牛源无乳链球菌M7菌株Sip基因的分子特征分析

通过PCR方法扩增Ⅰa型牛源无乳链球菌地方菌株M7的Sip基因,将目的片段克隆入pGEM-T Easy载体并进行测序,采用多种生物软件对Sip基因及其表达的蛋白质进行分子特征分析。试验结果表明,M7菌株的Sip基因为1305bp,未出现基因缺失;与GenBank中发表的不同血清型的无乳链球菌菌株的相应核苷酸序列同源性为98.0%～100.0%,推导的氨基酸同源性为97.2%～99.8%。M7的Sip基因与中国菌株Ly2(FJ808732)和美国菌株GB00549(FJ752159)的相应基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性均为100.0%,氨基酸同源性均为99.8%。该Sip基因表达的蛋白质是一种稳定的分泌性外膜蛋白,疏水性强;其N-末端的第52-95位氨基酸残基之间含有1个LysM超家族的保守结构域;存在1-25位氨基酸的信号肽,剪切位点在第25-26位氨基酸之间;存在多个B细胞和T细胞表位。说明M7菌株的Sip基因是未缺失LysM超家族结构域的比较保守的免疫蛋白。

无乳链球菌Sip基因的克隆与原核表达

无乳链球菌表面免疫相关蛋白(Surface immunogenic proteins,Sip)具有高度保守性,是无乳链球菌疫苗研究的重要靶标。通过PCR技术扩增Sip基因,将其插入pET-22b载体构建重组质粒pET-22b-Sip,并对重组质粒进行双酶切、PCR鉴定及测序;转入BL21(DE3)中诱导表达,检测重组蛋白的大小及反应原性。结果表明,所扩增Sip基因大小为1 300bp,与GeneBank参考序列同源性为99.16%;蛋白分析表明,目的蛋白大小为50KDa,具有良好的反应原性,为无乳链球菌的免疫预防提供依据和基础。