中国丽赤壳属Calonectria真菌物种及遗传多样性

丽赤壳属(Calonectria)真菌中含有一些在世界范围内分布广且危害大的病原菌。通过基于多基因序列的系统发育分析并结合形态学特征,我国共发现并鉴定了28个丽赤壳属物种,其中27个种是在桉树人工林叶片、桉树林下土壤或者桉树苗上发现。本文对我国丽赤壳属真菌的物种多样性以及遗传多样性进行了概述,对各个物种的形态特征、菌落特点、寄主范围、分布地域和危害特点等进行了详细的描述,并对未来我国丽赤壳属真菌的物种分类以及引起病害的防控研究提供了思路。

锯叶棕苗期叶斑病菌(Calonectria pteridis)生物学特性及其对11种杀菌剂的毒力反应

对锯叶棕苗期叶斑病病原菌（Calonectria pteridis）的生物学特性进行初步研究,结果表明：该病原菌菌丝生长适宜温度范围为28~30℃,适宜生长pH范围为5.0~6.0;分生孢子萌发最适温度为28℃,最适pH为5.5。菌丝对碳源的利用效果由高到低依次为D-木糖、D-果糖、蔗糖、D-葡萄糖、D-山梨醇、D-乳糖、D-麦芽糖和肌醇;对氮源的利用效率以草酸铵最高,明显优于其他氮源,而分生孢子的萌发受不同碳、氮源的影响较小。在室内采用菌丝生长速率法,测定11种杀菌剂对菌丝生长的抑制作用,结果表明：50%多菌灵和70%甲基托布津的EC50值最小,分别为0.486 4和2.958 9 mg/L;而80%代森锌和15%三唑酮的EC50值最大,分别为130.160 3和159.737 9 mg/L,抑菌效果最差。

Calonectria真菌在中国桉树上的分布和危害

由丽赤壳属真菌导致的焦枯病是世界范围内桉树的重要病害之一,焦枯病给我国桉树人工林带来一定的危害。本文简要概括了丽赤壳属真菌的物种多样性、地理分布和寄主范围;阐述了丽赤壳属病原菌对桉树的危害特征和在桉树上的物种多样性;总结了针对丽赤壳属真菌测试其致病力的接种方法和孢子诱导方法;概述了丽赤壳属真菌物种对桉树的致病力特征。

14种桉树基因型对叶焦枯病病原菌抗病性研究

由丽赤壳属真菌引起的叶焦枯病是我国桉树人工林重要病害,选育抗病品种是防控该病害的重要途径之一。本研究将引起桉树叶焦枯病的3种丽赤壳属病原菌,通过孢子悬浮液(浓度为5×10^(4) conidia•mL^(‒1))喷雾接种法接种至14个桉树基因型苗木,通过比较感病指数来评估不同桉树基因型的抗病性。结果表明:不同丽赤壳属病原菌物种对同一桉树基因型的致病力存在差异,不同桉树基因型对丽赤壳属病原菌的抗病性差异达显著水平,其中桉树基因型GZ-1的抗病性最强。本研究结果拟为桉树人工林抗病基因型的选择提供一定的理论指导。

澳洲坚果褐腐病的病原菌鉴定及生物学特性

对云南景洪发生的澳洲坚果果实褐斑病进行了病原菌分离鉴定和生物学特性研究。经致病性测定、形态学和分子生物学鉴定,病原菌为Calonectria pentaseptata。生物学特性研究表明,该菌菌丝生长的适温为25~30℃,孢子萌发的适温为20~25℃,光照对菌丝生长影响不明显,紫外光对分生孢子的萌发有显著影响,不同的糖溶液可促进分生孢子的萌发。

中国桉树焦枯病病原菌物种多样性及致病力初步分析

为了明确中国桉树焦枯病病原菌的物种多样性、生物学特性和致病力强弱，本试验对在中国报道的桉树焦枯病病原菌进行了形态学比较，β-tubulin、HistoneH3、TEF-1α三段基因系统发育学分析，并测定各病原菌在7个温度下的菌落生长速度，以及对4个桉树无性系（DH32—29、广州1号、广林4号、OC14）离体叶片的致病力大小。结果表明．到目前为止我国桉树焦枯病病原菌分属6个不同的物种，分别是Ca．cerciana、Ca.crousiani、Ca.pauciramoso、Ca.pseudocolhounii、Ca.pseudoreteaudii和Ca.fujianensis。不同病原菌的形态存在一定差异．病原菌分属于不同的系统发育树分枝。被测试病原菌的最适生长温度为20～30℃，在5℃和35℃下均停止生长。被测试的5种桉树焦枯病病原菌在4个桉树无性系上的致病力差异显著，总体致病力强弱顺序为：Ca.cerciana〉Ca.pauciromosa〉Ca．pseudoreteaudii〉Ca．crousiana〉Ca.fujianensis。桉树无性系对不同种桉树焦枯病病原菌的抗性存在显著差异。研究结果显示桉树焦枯病病原菌物种存在多样性，各病原菌的致病性差异显著．有针对性地选择抗特定病原物种的桉树无性系是解决桉树焦枯病危害的一条有效途径。

桉树焦枯病菌ABC转运蛋白的鉴定与分析

[目的]利用生物信息学方法探讨ABC转运蛋白在焦枯病菌对桉树侵染过程中的解毒作用,为揭示桉树焦枯病致病机制奠定基础。[方法]本文利用BLAST、HMMER、Pfam数据库、TCDB数据库在全基因组内对桉树焦枯病菌的ABC转运蛋白进行鉴定和分类,并通过Prot Camp和IBS分别进行亚细胞定位和结构域图绘制,依据同源性对其功能进行推测分析。[结果]表明:桉树焦枯病菌共有70个ABC转运蛋白,它们分属于8个亚族。71%的转运蛋白位于细胞膜,10%位于液泡,其余部分位于线粒体、过氧化物酶体、内质网等内膜系统上。桉树焦枯病菌ABC转运蛋白包含全分子、四分之三分子、半分子及四分之一分子。根据同源性推测桉树焦枯病菌ABC转运蛋白与MDR、PDR、HMT、MPE、STE、P-FAT等几种转运蛋白具有较高相似性,同时还与核糖体合成、翻译、过氧化物酶体合成的ABC转运蛋白具有较高相似性。[结论]桉树焦枯病菌ABC转运蛋白除作为外排泵转运外源化学物质、疏水性化学分子等物质。还参与细胞代谢、翻译、核糖体的合成、mRNA的输出、β氧化,并通过为辅酶Q的辅助因子增强呼吸代谢等多项生命活动为焦枯病菌的侵染提供能量。

桉树焦枯病菌原生质体制备条件的优化

以桉树焦枯病强致病菌株Calonectria pseudoreteaudii YA51为材料,对其原生质体生成条件进行优化.结果表明,收集1 g(湿重)培养24 h的菌丝,以0.8 mol·L^(-1)Na Cl为渗透压稳定剂,置于10 m L含20 mg·m L^(-1)崩溃酶和30 mg·m L^(-1)裂解酶的混合酶液中,在30℃、100 r·min^(-1)条件下裂解4 h,原生质体生成量可达3.72×107个·m L^(-1),在SR培养基上的再生率为32.33%.

12种桉树焦枯病病原菌对10种桉树无性系致病性初步分析

为了明确在中国发现的桉树叶片焦枯病病原菌Calonectria spp.对桉树的致病力大小,并测定不同桉树无性系对Calonectria病原菌抗病性的强弱,本试验采用在中国发现的12种Calonectria属(Ca.cerciana、Ca.chinensis、Ca.hongkongensis、Ca.microconidialis、Ca.papillata、Ca.parakyotensis、Ca.pauciramosa、Ca.pentaseptata、Ca.pseudoreteaudii、Ca.seminaria、Ca.terrestris、Ca.tetraramosa)共29株致病菌对10个桉树无性系(DH32-22、DH32-29、EC152、EC153、EC155、G1、K31、OC14、U6、W5)进行了室内离体叶片致病性测定。结果显示:12种被测试Calonectria病原菌均能在不同程度上使10个桉树无性系离体叶片产生病斑;不同种Calnectria病原菌对同一桉树无性系的致病性差异显著,不同桉树无性系对同种Calonectria致病菌的抗病能力也存在显著差异。

国内外桉树焦枯病研究进展

桉树焦枯病是一种世界性土传病害,严重影响桉树的正常生长。本文主要对桉树焦枯病的病原、病害特征、危害状况、桉树抗病性及防治方法等方面进行了概述。

桉树PAL基因克隆及焦枯病菌诱导下的表达分析

[目的]克隆桉树苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及在焦枯病菌诱导下的表达特征,为探究桉树抗焦枯病机理提供理论支撑。[方法]通过SOE-PCR技术从尾细桉M1中克隆PAL基因,利用real-time PCR分析其在焦枯病菌诱导下的表达特性。[结果]克隆得到尾细桉M1 PAL基因,其ORF序列长2142 bp,编码713个氨基酸,与其他已发表的桉树PAL相似性均在99%以上。序列分析发现,其编码蛋白是一类稳定的亲水性蛋白,含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,具有典型的苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构域。进一步分析桉树不同品系PAL基因的表达趋势,结果发现,不同品系PAL基因在焦枯病菌诱导下均表现为明显的上调表达,且抗性越强,PAL基因越早上调,上调表达量越大。[结论]从尾细桉M1中克隆得到的PAL基因具有典型的PAL家族成员特征,推测该基因可能通过参与酚类防御性物质或者信号分子SA等物质的合成,进而在桉树抵抗焦枯病菌侵染的过程中发挥重要作用。

木本植物粗提物对桉树焦枯病菌的抑制作用

桉树焦枯病成为制约桉树生产的重要因素之一,使用环境友好型的杀菌剂是防控桉树焦枯病的有效途径之一。植物源抑菌剂由于具有生态安全的特点,已作为开发新型农药的重要成分而备受关注。以广玉兰、银杏、八月桂等11种植物为供试材料,分别用蒸馏水和无水乙醇进行低温浸提,研究粗提物对2种桉树焦枯病病原菌类柯氏丽赤壳和瑞丽赤壳的生长抑制作用。结果表明,在1 g·m L-1的浓度处理下,对桉树焦枯病菌瑞丽赤壳抑制效果最好的是银杏水粗提物,抑制率达到了100%;其次是红花檵木水粗提物,抑制率达到了94.28%;广玉兰无水乙醇粗提物对桉树焦枯病菌类柯氏丽赤壳的抑制效果最好,抑制率达到了73.36%;银杏、红花檵木和广玉兰在开发桉树焦枯病新型抑菌剂中具有潜在价值。

桉树焦枯病菌内参基因的筛选

为筛选出桉树焦枯病菌在盐胁迫及侵染桉树叶片两种条件下表达稳定的内参基因,采用实时荧光定量聚合酶链式扩增反应(RT-q PCR)技术分析了桉树焦枯病菌中7个常用内参基因(GAPDH、α-tubulin-1、α-tubulin-2、18S rRNA、ubiquitin、β-actin、β-tubulin)的mRNA差异表达情况,并采用ge Norm软件分析了它们在两种条件下的表达稳定性。结果表明,ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下表达最稳定的基因,且不需要引入第3个基因;18S rRNA和α-tubulin-1为侵染桉树叶片下表达最稳定的基因,但需引入第3个基因GAPDH。因此,ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下较适合的内参基因,而18S rRNA、α-tubulin-1和GAPDH为侵染桉树叶片较适合的内参基因。

蓝莓叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性

为明确蓝莓叶斑病病原菌种类及其生物学特性,采用组织分离法和单孢分离法对病原菌进行分离纯化,通过形态学特征和多基因联合序列分析进行病原鉴定,采用叶片涂抹接种法测定其致病性,并于室内对其生物学特性进行研究.结果表明,从发病蓝莓叶片分离得到3株形态特征一致的菌株,代表菌株LC-1菌落呈深棕色,菌丝白色至浅红棕色;大型分生孢子梗无色透明,长303~410μm,分枝末端产生2~4个瓶梗;囊泡棒状,大小为(12~30)μm×(2~5)μm;大分生孢子无色透明,圆柱形,两端半圆形,大小为(48~82)μm×(4~7)μm.采用Act,H3,EF-1α和β-tub 4段基因联合构建系统发育树,供试菌株LC-1与柯氏丽赤壳菌(Calonectria colhounii)聚在同一分支.蓝莓叶片接种菌株LC-1后出现典型的叶斑症状.根据形态学特征和系统发育分析,将该病原菌鉴定为柯氏丽赤壳菌.生物学特性研究结果表明,菌丝最适生长温度为25℃,最适pH值为7,该菌对可溶性淀粉的利用最好,菌丝生长的最适氮源为甘氨酸.

浙江省大豆红冠腐病的病原菌鉴定

大豆红冠腐病(red crown rot of soybean,RCR)是世界范围内的重要的大豆病害之一,病害症状为罹病植株茎基部变红,表面聚集了大量橙红色球状子囊壳。对采自浙江省桐庐县的疑似大豆红冠腐病的病原进行分离和培养,从分离获得的菌株中选择1个代表菌株ZJHZ01进行后续试验和分析,为浙江省大豆产区的红冠腐病的防控提供依据。致病性测定结果表明:菌株ZJHZ01接种大豆茎基部可引起发病,回接症状与田间自然发病症状较为相似。病原菌落初为白色,后变为鹅黄色,菌落中可产生大量红褐色微菌核和厚垣孢子,在PDA、V8和康乃馨叶片培养基中极易产生子囊孢子,与已报道的大豆红冠腐病菌的菌落形态特征相似,初步认为ZJHZ01为冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)。进一步在分子生物学水平上,对其TUB、HIS和EF-1α序列进行PCR扩增和测序,对比Gen Bank中已经录入的丽赤壳属相应序列。基于以上3种基因联合序列,通过采用邻接法构建了的系统发育树。结果表明:菌株ZJHZ01与Gen Bank中C.ilicicola菌株GDBL01存在着极高的同源性,序列相似度达到了99%以上。通过对浙江省桐庐地区大豆产区的大豆病株的病原菌进行致病性、形态学和分子生物学分析,明确了浙江省桐庐大豆产区的红冠腐病是由C.ilicicola侵染所致,这是该病害在浙江省的首次报道。

EuPOD基因克隆与焦枯病菌胁迫表达分析

植物过氧化物酶是植物体内活性氧清除过程中的关键酶之一,在植物的抗逆性中发挥着重要作用。以对焦枯病菌高抗品系尾细桉为材料,克隆得到一个POD基因序列,并命名为Eu POD,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检验该基因在尾细桉叶片中的表达。结果表明该基因cDNA长999 bp,其编码蛋白由332个氨基酸组成;基于氨基酸序列的系统进化树分析表明,EuPOD在进化上与蓖麻、可可、苹果的同源基因亲缘关系较近,相似性达到了75%,与拟南芥的相似性达到65%,与水稻的相似性较低,只有48%。Eu POD在桉树焦枯病菌侵染后不同时间所受诱导表达量不同,在12 h的表达量达到高峰。

桉树叶片内生真菌多样性及抗桉树焦枯病菌筛选

采用组织分离法从福建省5个地区的桉树叶片中获得87株内生真菌,鉴定为7目及2个未定目,含15属及1个未定属,20种和1个未定种;其中Pseudoplagiostoma eucalypti菌株数量占总数的0.32,为优势种类。龙岩采样点桉树叶片内生真菌辛普森多样性指数为0.92,福州采样点的桉树内生菌香农-威纳指数为2.13,分别高于其它4个地点。经筛选,发现87株内生真菌中,哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ND-13的菌丝能够覆盖桉树焦枯病菌(Calonectria pseudoreteaudii)菌落并抑制其生长;显微观察显示,ND-13菌丝缠绕病原菌菌丝;检测发现ND-13不产生几丁质酶,但产生β-葡聚糖酶。研究结果显示桉树叶片内生真菌种类丰富;ND-13具有防治桉树焦枯病的潜力,表明从桉树内生真菌中筛选抗桉树焦枯病菌是可行的。

桉树焦枯病菌CpSit1基因的鉴定与表达

利用Blast及TCDB数据库对桉树焦枯病菌(Calonectria pseudoreteaudii)的Cpsit1基因进行鉴定;再利用SMART数据库和Prot Param、TMHMM、PHD、Pro Comp 9.0在线分析工具对Cpsit1基因编码蛋白的理化性质、跨膜螺旋、蛋白质二级结构和亚细胞定位进行预测分析;最后采用qRT-PCR方法对CpSit1基因在焦枯病菌侵染桉树过程中的表达情况进行分析.结果表明:CpSit1基因长度为1 780 bp,其编码的蛋白序列共有592个氨基酸残基组成,并将其鉴定为铁载体-铁:H+同向转运蛋白.其保守结构域为MFS_1;共含有14个跨膜螺旋;在二级结构中α螺旋占45.10%,延伸链占26.01%,无规则卷曲占28.89%.通过qRT-PCR相对定量的方法分析焦枯病菌侵染桉树24、48和72 h后CpSit1基因的表达情况,结果显示,CpSit1基因在这3个时段均发生上调表达,但24 h的表达量明显大于48和72 h.说明桉树焦枯病菌CpSit1基因在病原菌侵染寄主的过程中通过调控铁载体-铁化合物的转运来完成铁元素的摄入,协助其在寄主中的定植.

6种杀菌剂对不同桉树焦枯病病原菌的室内毒力测定

由丽赤壳属(Calonectria)真菌引起的桉树焦枯病是桉树世界范围内的重要病害之一。为了筛选能有效抑制丽赤壳属病原菌的杀菌剂,本研究采用6种杀菌剂(百菌清、代森锰锌、多菌灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、咪鲜胺)对5种桉树丽赤壳属病原菌(Ca.cerciana、Ca.crousiana、Ca.fujianensis、Ca.pauciramosa、Ca.pseudoreteaudii)通过菌丝生长法测定其室内毒力强弱。结果显示:6种杀菌剂对5种丽赤壳属病原菌均有一定的抑制作用,且差异显著。不同杀菌剂对同一丽赤壳属病原菌的抑制效果差异显著,不同丽赤壳属病原菌对同一杀菌剂的敏感性也存在差异。综合比较分析,咪鲜胺能有效发地抑制本研究中测定的丽赤壳属病原菌菌丝生长。

基于ITS与factor1-alpha序列桉树焦枯病菌的双重PCR快速检测

桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害,建立准确、有效的桉树焦枯病的PCR快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。试验以桉树焦枯病原菌(Calonectria morganii)DNA为模板,分别以ITS和factor 1-alpha序列为靶区域,针对Calonectria属和C.morganii设计了CYS1/CYS2和EF-S-1/EF-A-1两对特异性引物,建立了基于属和种的双重PCR快速检测技术。利用引物CYS1/CYS2可以从全部Calonectria属的供试菌株中扩增出一条351bp大小的条带,单独用特异性引物EF-S-1/EF-A-1进行PCR扩增,仅病原菌扩增出197bp的条带,同时使用2对引物时,病原菌可扩增出两条明亮条带。当体系退火温度为53℃时,DNA灵敏度检测限度达到450fg/μL。野外田间时效检测结果显示,该体系能准确检测出不同发病程度桉树组织上的病原菌,完全符合田间检测的要求。这是关于桉树焦枯病快速检测的首次报道。