表达外源基因SPAM1重组CAV-2溶瘤病毒的构建与拯救

旨在研究犬腺病毒-2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)作为溶瘤病毒的潜力并进一步探索精子黏附因子(SPAM1)协同CAV-2重塑肿瘤微环境在肿瘤免疫治疗中的应用价值。本研究以P15A-CAV-2反向遗传操作平台为基础,使用RED/ET同源重组系统构建携带SPAM1外源基因的中间载体,使用中间载体将CAV-2骨架载体E3区域缺失并替换SPAM1外源基因表达盒。再利用合成引物敲除kmccdB反向筛选表达盒构建P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA感染性克隆质粒并在MDCK-E1A细胞系中拯救重组溶瘤病毒,对重组病毒体外溶瘤效应进行验证。根据测序与酶切验证结果证明,本研究成功构建并拯救出稳定表达外源基因SPAM1的重组溶瘤病毒1株;IFA试验证明,重组毒株能够高水平稳定表达外源基因且外源蛋白具有可弥散分布于细胞间的特点。缺失E3区域表达外源基因SPAM1的重组溶瘤病毒通过光镜观察和CCK8检测发现具有对犬癌细胞系A72强烈的杀伤效应。综上,本研究成功构建1株具有良好溶瘤效应的重组CAV-2,为后续应用于宠物肿瘤治疗奠定了基础。

I型犬腺病毒黑龙江株(CAV-H)的分离、鉴定及致弱的研究

为研究犬腺病毒(CAV)致弱疫苗的免疫原性,本研究将病犬的组织样品接种于MDCK细胞内,进行病毒分离及鉴定。鉴定结果显示,分离的病毒在MDCK细胞内产生明显的细胞病变(CPE),电镜下可见典型的腺病毒粒子;回归动物试验显示,该分离株可导致犬出现明显的CAV感染症状;PCR鉴定结果表明分离的病毒为CAV,命名为CAV-H株;将CAV-H株接种MDCK细胞连续传代至110代,在传代过程中,病毒滴度由初始105.0 TCID50/0.1 mL上升至107.0 TCID50/0.1 mL,而CAV对犬的致病力逐渐降低;免疫效力试验结果表明,CAV-H可对同源强毒攻击的犬提供完全的免疫保护作用,可作为理想的疫苗候选毒株。

CDV、CPV、CAV-2及CPIV多重PCR的建立及应用

为建立一种快速检测犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(CAV-2)和犬副流感病毒(CPIV)的多重PCR方法,参照Gen Bank中的相关病毒基因序列,分别设计了4对引物,用于特异性扩增CDV H基因、CPV VP2基因、CAV-2 E3基因和CPIV NP基因上的目的片段。通过优化反应条件,建立了同时扩增CDV(410 bp)、CPV(253 bp)、CVA-2(655 bp)和CPIV(868 bp)的多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法,对CDV、CPV、CAV-2、CPIV、CDV+CPV+CAV-2+CPIV和犬冠状病毒(CCV)的DNA或c DNA模板进行扩增,发现该方法的特异性良好。利用建立的多重PCR方法与单一PCR方法进行敏感性比较,发现两者敏感性相差10倍,证明多重PCR方法敏感性良好。利用该方法对从北京市采集的30份犬病料样品进行检测,发现CDV阳性率为63.33%(19/30)、CPV阳性率为33.33%(10/30)、CAV-2阳性率为6.66%(2/30)、CPIV阳性率为0(0/30)。检测结果证明建立的多重PCR方法可用于临床诊断。

抗CDV、CAV卵黄抗体的制备

本研究用CDV、CAV分别免疫产蛋鸡 ,收集鸡蛋 ,用海藻酸钠_硫酸铵法提取卵黄抗体 (IgY) ,并对提取的IgY采用了SDS_PAGE和低压层析检测纯度 ,结果表明用该法提取的IgY纯度较高。用间接ELISA测定提取的IgY的活性 ,结果证明提取的抗CAVIgY的活性较高 ,而抗CDVIgY的活性损失较大。

驯化克隆的CAV-2大斑株的实验免疫研究

对MDCK细胞上驯化克隆产毒量高的大斑株 (LP)的第 5 0代毒和 75代毒进行了实验免疫研究 ,结果表明该毒株具有安全性好 ,通过静脉和口鼻接种CAV易感犬 ,无任何致病反应 ;用10 4 .0 TCID50 以上的该毒免疫CAV易感犬 ,即获得 97.5 %以上的免疫保护 ;将其在CAV易感犬连续传 5代 ,其安全性与原毒相同 ,表明该毒株在 5 0～ 75代之间遗传性稳定 ,免疫原性良好 ;与CPV和CDV弱毒联合免疫 ,结果与各弱毒单独免疫所产生的抗体无差异 ,说明该毒株不但可以单独用于免疫 ,也可与其他弱毒联合免疫。是一株较好的疫苗候选株 ,具有开发应用价值。

犬腺病毒CAV-BJ02株的分离与鉴定

本研究旨在分离犬腺病毒(CAV)的北京地区流行株,采集北京地区某宠物医院2~4月龄发生咳嗽等呼吸道症状犬的鼻咽拭子,经胶体金和PCR检测,初筛为犬腺病毒阳性。经过处理后,将其处理液接种于MDCK细胞,进行连续传代培养,出现变圆、脱落、葡萄串样等特征性细胞病变。通过形态学观察、PCR鉴定及动物回归试验等方法对其进行鉴定。PCR扩增片段测序结果表明,该分离株为犬腺病毒Ⅱ型,遂将其命名为CAV-BJ02(GenBank:MN744708)株。用Reed-Muench法测得CAV-BJ02株的TCID 50为106.7·(100μL)-1。电镜下可清晰地观察到呈正六边形的二十面体、直径在86 nm左右的犬腺病毒颗粒。遗传进化分析结果表明,本株病毒为CAV-Ⅱ型。动物回归试验结果表明,CAV-BJ02株可引起犬发热等轻微临床症状,以口鼻分泌物为主要排毒方式,排毒期为5~6 d,不导致犬死亡。上述研究结果为深入了解北京地区CAV的流行情况,为犬腺病毒病的诊断、防治及后续相关研究奠定了理论基础。

CDV、CAV疫苗三免后鸭蛋卵黄抗体制备及效价消长规律探究

利用犬瘟热商品疫苗和狐狸脑炎商品疫苗分别免疫开产蛋鸭,三免后收集高免鸭蛋,用水稀释法和硫酸铵两步沉淀法提纯卵黄抗体。采用SDS-PAGE检测鸭源Ig Y浓度,中和试验和HA-HI试验测定相应效价。结果表明,水溶法制备的卵黄抗体浓度为6.33 mg/m L,得率为60%-70%。免疫CDV疫苗组和CAV疫苗组可以很快产生特异性抗体。在30-60 d内,卵黄抗体效价极高;在60-120 d内,卵黄抗体效价维持较高水平;在120-180 d内,效价趋近于零。

犬瘟热病毒和犬腺病毒2型双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立犬瘟热病毒(CDV)和犬腺病毒2型(CAdV-2)双重TaqMan荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。本试验针对CDV的N基因和CAdV-2的E3基因设计两对特异性引物与两条标记不同荧光基团的TaqMan-MGB探针,对引物、探针的浓度、反应体系和反应条件进行优化后检测该方法的灵敏度,特异性及重复性。结果:该方法在CDV和CAdV-2阳性参考质粒浓度1×10^(1)~1×10^(7) copies/μL的范围中,R2值为0.997和0.993,表明所建的标准曲线具有良好线性关系,能检测到最低浓度为5 copies/μL,并对其他病原无扩增现象,特异性良好;重复性试验中组内和组间变异系数小于1.54%。综上,建立的双重TaqMan RT-qPCR检测方法具有灵敏度高且特异性好等优点,可用于CDV和CAdV-2临床快速检测和鉴别诊断及流行病学调查等领域。

犬腺病毒2型的分离鉴定和致病性分析

为了解湖北省犬腺病毒2型(CAV-2)的基因遗传变异特征,本试验从武汉市某比格犬养殖场采集免疫过犬四联活疫苗的临床发病犬的眼、鼻和肛拭子,将经PCR检测为CAV-2阳性的病料接种犬肾细胞(MDCK细胞)进行病毒分离,对CAV-2分离株进行电子显微镜观察和间接免疫荧光鉴定,E3、Fiber、Penton和E1b基因PCR扩增和测序分析以及致病性试验。结果显示:经分离和鉴定共获得3株CAV-2,分别命名为HB404株、HB405株和HB078株。3株CAV-2分离株的E3、Fiber、Penton和E1b基因与国外疫苗毒株相似性分别为98.4%~99.6%、99.3%~99.9%、99.8%~99.9%和99.5%~99.7%;3株分离株的E3、Fiber和Penton基因与国内流行毒株相似性分别为96.6%~97.5%、98.5%~99.7%和99.4%~99.9%。且3株CAV-2分离株与国外疫苗毒株在同一分支,与国内流行毒株不在同一分支。HB405株能使犬出现精神不振、食欲减退、眼鼻有分泌物、打喷嚏和咳嗽等临床症状。结果表明,3株分离株的亲缘关系与国外疫苗毒株较近,HB405株为强毒株,能够使犬发病。本试验结果可为CAV-2的诊断和预防提供参考依据。

犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用

根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180s,96℃30s,56℃30s,72℃80s,30个循环。联合PCR结果显示:CAV-1扩增片段大小为497bp,CAV-2为1019bp,CPV为719bp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带。上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同。敏感性比较试验结果表明,联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感。将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA/HI试验。以上结果说明:CAV-1/CAV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2 5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒,因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值。

表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

对CAV-2的E3区的Ssp I片段进行缺失构建了E3区缺失载体pVAXΔE3,然后将CPV VP2表达盒连接到pVAXΔE3的E3区缺失处,构建了CPV VP2表达盒的转移载体pΔECPV-VP2,用SalI+NruI分别对pPoly2-CAV2和pΔECPV-VP2进行双酶切,分别进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,将含CPV VP2表达盒的SalI+NruI片段定向克隆入pPoly2-CAV-2载体,获得了含CPV VP2表达盒重组CAV-2基因组的质粒pCAV-2/CPV-VP2。用AscI+ClaI对pCAV-2/CPV-VP2进行双酶切,释放CAV-2/CPV-VP2重组基因组,将CAV-2/CPV-VP2基因组与去除SalI+NruI片段的CAV-2基因组的两个片段混合,利用脂质体介导共转染DK细胞,出现病变,获得重组病毒CAV-2/CPV。并且,从形态学、基因组水平、目的基因的转录及重组病毒的生长特征等方面进行了鉴定。结果证明,CAV-2/CPV具有典型的CAV-2形态特征,CAV-2/CPV在繁殖的过程中没有对CPV VP2表达盒片段进行缺失或重排,并且能够转录CPV VP2的mRNA。CAV-2/CPV的繁殖速度比野生型CAV-2的繁殖速度慢。

犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

核蛋白基因(N)位于犬瘟热病毒基因组的108—1679位置处,是保守性较强的免疫原性蛋白,因此选择N基因作为目的基因,利用酶切、连接等方法构建了含犬瘟热病毒核蛋白基因的穿梭质粒pVAX?E3LPN。以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建了重组质粒pCAV-2-CDVLPN,利用脂质体介导法转染MDCK细胞,转染三次后,细胞出现了典型的腺病毒样病变。电镜负染、切片观察,酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明表达犬瘟热核蛋白基因的重组犬2型腺病毒构建成功,表达的核蛋白分子量为58kDa。

表达狂犬病毒糖蛋白抗原的重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

为研制一种预防犬科动物狂犬病的新型疫苗,将含有狂犬病毒ERA株糖蛋白基因(Rabies glycoprotein,Rgp)表达盒的穿梭质粒pVAXΔE3Rgp中的Rgp表达盒克隆入犬2型腺病毒(Canine adenovirus type2,CAV2)骨架质粒pPoly2-CAV2中,获得重组质粒pPoly2-CAV2-ΔE3-Rgp,释放其基因组,转染MDCK细胞系,获得E3缺失区(Deletion of early protein3,ΔE3)含有Rgp表达盒的重组病毒CAV2-ΔE3-Rgp。该重组病毒能在MDCK细胞上产生典型的腺病毒细胞病变。通过酶切、PCR、基因测序,表明该重组病毒含有完整的Rgp表达盒。通过RT-PCR、Western blot等检测,表明该重组病毒能够表达Rgp抗原。用该重组病毒免疫犬,3次免疫后,可以诱导犬产生特异的抗CAV2HI抗体,其效价超过1∶256和抗狂犬病病毒(Rabies virus,RV)中和抗体,其效价超过0.50IU/mL。试验结果表明,获得的重组病毒免疫犬后,能够产生抗狂犬病毒和腺病毒的高效价保护性抗体,是一种有潜力的犬科动物狂犬病毒腺病毒二联疫苗候选株。

表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组犬2型腺病毒的构建及其免疫原性研究

为研制 1种以犬 2型腺病毒为载体的狂犬病疫苗 ,以狂犬病病毒SRV9株基因组为模板 ,通过RT_PCR技术扩增得到狂犬病病毒糖蛋白膜外区序列 ;以其为目的基因构建以CMV为启动子、SV4 0polyA为终止信号的表达盒。将犬 2型腺病毒的E3区克隆入中间质粒中 ,然后对其进行部分缺失 ,并将表达盒克隆入缺失处 ,再以此重组的E3区置换犬 2型腺病毒的E3区。以重组的犬 2型腺病毒基因组转染MDCK细胞 ,最终获得了表达盒分正向和反向插入E3区的重组犬 2型腺病毒。用两株重组腺病毒免疫幼犬 ,均在犬体内产生了针对狂犬病病毒的抗体。

同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、Ⅰ型和Ⅱ型犬腺病毒多重PCR方法的建立

为建立检测多种犬病的多重PCR方法,本研究根据GenBank登录犬瘟热病毒(CDV)的N基因序列、犬细小病毒(CPV)的NS基因序列和犬腺病毒(CAV)的E3基因序列,设计合成3对特异性引物。通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(507 bp)、CPV(287 bp)、CAV-Ⅰ(590 bp)和CAV-Ⅱ(1 027 bp)的多重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测以上4种病毒,而狂犬病病毒检测为阴性;CDV、CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的最低检出限分别为101.9TCID50、101.7TCID50、101.7TCID50和102.2TCID50。利用该方法对由黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为23.33%(7/30)、CPV阳性率为20%(6/30)、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的阳性率均为3.33%(1/30),证明建立的PCR方法可以用于临床诊断。

感染性犬2型腺病毒全基因组克隆及鉴定

以犬 2型腺病毒 (canine adenovirus type- 2 ,CAV- 2 )自然弱毒株 YCA18基因组 DNA为模板 ,经 PCR扩增分别获得其双链两末端 10 13bp(U)和 972 bp(D)的 DNA序列 ,以首尾相接方式克隆入载体 p Poly2 ,获得重组质粒p Poly2 - UD。以 Hind 和 Bst B 双酶切 p Poly2 - UD,回收含载体和部分 U、D的大片段并与 CAV- 2 DNA共转化感受态 E.coli Sure TM,经菌体内同源重组 ,获得含有 CAV- 2全基因组序列的重组质粒 p Poly2 - CAV- 2。后者以 Cla 和 Asc 双酶切 ,释放 CAV- 2全基因组 ,通过脂质体介导转染 MDCK细胞 ,盲传 3代后重复转染 1次 ,4d后 ,出现腺病毒典型病变。细胞上清血凝效价为 1∶ 6 40 ,并可被 CAV- 2抗血清有效抑制。以上结果表明 ,本研究获得了具有感染性的CAV- 2全基因组重组质粒 ,为以 CAV- 2作为重组疫苗载体的系列研究奠定了重要基础。

冀、京、吉犬群犬腺病毒中和抗体调查

目的为表达狂犬病病毒糖蛋白的犬2型腺病毒(CAV-2)重组狂犬病口服疫苗的投放工作提供流行病学依据。方法通过病毒中和试验对随机采自河北省,北京市,吉林省等地的387份犬血清进行犬腺病毒中和抗体检测,以确定犬群腺病毒感染率。结果河北、吉林农村流浪犬或家养犬腺病毒中和抗体阳性率较低,阳性率为16%(30/192),而北京市犬腺病毒中和抗体阳性率高达69%(135/195),说明城乡犬只犬腺病毒中和抗体存在明显差异。结论农村流浪犬或家养犬腺病毒中和抗体阳性率较低,适用于CAV-2及其重组疫苗首次免疫、尤其是口服免疫。

犬腺病毒SY-45株不同大小蚀斑特性研究

应用蚀斑方法将 SY- 4 5毒株经过 3次蚀斑纯化直到蚀斑大小相对稳定。从不同大小的蚀斑中挑选出三种蚀斑 ,大斑直径约 3mm (简称 LP)、中斑约 2 mm(简称 MP)、小斑约 1 mm(简称 SP)。分别在 MDCK细胞上增殖并进行了三种不同大小斑毒对犬的毒力、免疫原性和在 MDCK细胞上产毒量比较 ,以筛选最佳的疫苗株 ,试验结果表明用不同大小蚀斑病毒大剂量人工感染易感犬后 ,所有的试验犬临床症状和病理解剖学和病理组织学表现均正常 ;对挑选的 4窝 CAV HI抗体效价小于等于 1 :2的健康幼犬进行免疫试验 ,测定血清的中和抗体效价和血凝抑制抗体效价 ,结果表明 :大斑毒的免疫原性要稍高于中斑毒 ,而明显高于小斑毒 ;不同大小蚀斑毒在 MDCK细胞上产毒量差异很大 ,大斑毒可达 1 0 7TCID50 / m L、小斑毒达 1 0 6 TCID50 /ml、小斑毒达 1 0 4 .5TCID50 / m L。综合所有试验结果表明 :大斑毒株具有产毒量高、安全性好、免疫原性强的优点 ,是较为理想的疫苗株。

犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3(NF)(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体LipofectamineTM2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。