重组Canstatin蛋白联合氟尿嘧啶治疗胰腺癌

目的:探讨血管生成抑制剂Canstatin与细胞毒药物5-FU联合应用治疗胰腺癌的效果,以期探索胰腺癌治疗新途径.方法:胰腺癌SW1990细胞(1×107/只)注射到32只裸鼠皮下,建立胰腺癌皮下移植瘤模型.当肿瘤长至2-3mm时,随机分4组,即PBS(0.3mL/d)对照组、5-FU(12.5mg/(kg·d)×5d)治疗组、Canstatin(10mg/(kg·d)×3wk)治疗组、及5-FU[12.5mg/(kg·d)×5d]+Canstatin[10mg/(kg·d)×3wk)]联合治疗组,给药途径均为ip.治疗期间,定期用圆规和游标卡尺测量皮下移植瘤大小.疗程结束时,取下瘤体,常规病理切片,观察药物毒性反应,CD34免疫组化染色,检测肿瘤内微血管密度(MVD).结果:Canstatin治疗组移植瘤体积从第10天起显著小于对照组(P<0.01),5-FU治疗组第7天起就显著小于对照组(P<0.05),而联合治疗组自第3天起,移植瘤体积就显著小于对照组(P<0.05).疗程结束时,联合治疗组小鼠移植瘤体积显著小于其余各组(P<0.01),抑瘤率最高,达83.2%.治疗期间,各实验组未观察到明显毒性反应.免疫组化染色显示,Canstatin组(25.2±3.7)和联合治疗组(22.0±4.8)治疗小鼠肿瘤组织内MVD显著低于对照组(36.8±9.4)和5-FU治疗组(31.6±4.0)(P<0.05),而5-FU治疗组与对照组间无显著差异.结论:重组人Canstatin蛋白能有效抑制人胰腺癌生长,无明显副作用,作用机制是抑制肿瘤新血管形成,与细胞毒药物联合使用,具有协同作用,为胰腺癌治疗提供了新的有力的治疗方法.

重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定

目的:克隆并表达canstatin基因,初步检测其抑制血管生成的活性。方法:采用RT-PCR方法从人胚肝组织中钓取canstatin cDNA,克隆入pMD18-T载体中,并测序鉴定。在QIA表达系统中表达,Ni柱亲和层析纯化。进行生物学活性鉴定。结果:经序列分析所获684 bP人canstatin基因与报道一致,重组进pQE30表达载体,IPTG诱导表达并纯化成功,表达产物能明显抑制血管生成。结论:成功构建人canstatin cDNA克隆和表达载体并在大肠杆菌M15中高效表达。纯化回收产物在鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)实验中具有明显抑制血管生成活性。

canstatin基因转染对肺癌A549细胞和血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的 肿瘤的生长和转移需要大量新血管的生成,人血管能抑素(canstatin)是新近发现的高效内源性血管生成抑制剂,其抑制血管内皮细胞的作用已引起人们广泛关注。本研究的目的是探讨can statin基因在人肺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞HUV ECC中的表达及意义。方法 将canstatin基因通过电穿孔的方法转染人肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUV ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS PAGE电泳检测canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果 canstatin在转染组A549 细胞和ECC细胞表达并分泌至上清液中。canstatin基因转染组ECC的凋亡率(16.04%)显著高于空载体组(0.43%)和亲代细胞组(2.92%)(P<0.01),转染细胞生长明显受抑(P<0.01)。而转染组A549细胞的凋亡率(0.19%)与空载体组(0.13%)及亲代细胞组(0.07%)比较无显著性差异(P>0.05),细胞生长也未受明显影响。结论 canstatin能特异地抑制内皮细胞增殖,并诱导内皮细胞凋亡。

中国人Canstatin基因的克隆

目的 Canstatin是新近发现的血管生成抑制剂 ,具有很强的抑制肿瘤血管生成的功能 ,本研究拟克隆和鉴定中国人的Canstatin基因 ,为进一步研究Canstatin基因的功能奠定基础。方法 用RT PCT法从中国人肝组织中获得Canstatin的cDNA ,克隆到pCMV Script载体中测序 ,并在GenBank中进行同源性分析。结果 成功克隆了Canstatin基因cDNA编码序列并获得测序证实。结论 中国人Canstatin基因编码序列 ,经同源性分析与国外文献报道序列一致 ,初步证明该基因可能属于人类基因中序列保守的基因。

canstatin基因在体外培养血管内皮细胞中的表达及其意义

目的探讨canstatin基因通过电穿孔法在体外培养人脐静脉内皮细胞中的表达及对其生长与凋亡的影响。方法将canstatin基因通过电穿孔法转染人脐静脉内皮细胞HUV-ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用RT-PCR检测canstatin在转基因细胞mRNA中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果检测到canstatin在转染人脐静脉内皮细胞中的表达,canstatin基因转染内皮细胞组的凋亡率(16.90%)高于空载体组(1.47%)和亲代细胞组(2.85%)(P<0.01),转染细胞生长明显受抑。结论canstatin能特异地抑制血管内皮细胞增殖,并诱导细胞凋亡。

人canstatin基因原核载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的:构建人血管能抑素canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出其重组蛋白。方法:从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增canstatin cDNA,克隆进质粒pUCm-T,转化E.coliDH5α,测序正确后,酶切目的基因片段,插入质粒pET-22b(+),转化E.coliBL21,IPTG诱导蛋白表达,N i-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因canstatin长度一致。RT-PCR纯化产物与载体pUCm-T连接后,经蓝白斑筛选,挑出6个白色菌落做酶切鉴定。其中一个菌落被证实为阳性克隆,测定其基因序列,结果显示与Genbank公布的canstatin基因序列完全一致。将canstatin cDNA,插入质粒pET-22b(+),转化E.coliBL21,培养过夜后,挑选7个白色菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆。IPTG诱导其中一个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白表达条带,诱导1、2、3、4 h后,表达蛋白分别占菌体总蛋白的18.2%、18.8%、23.0%和23.4%。将诱导3 h的菌体超声破碎后,N i柱亲和层析,125和250 mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带。结论:成功构建人canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出canstatin重组蛋白,为深入研究其临床应用打下基础。

小鼠canstatin及其N端片段在大肠杆菌BL21中的表达

以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT PCR扩增小鼠canstatin及其N端片段基因,克隆到pMD18 T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin及其N端片段基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,分别构建表达质粒pET/Can和pET/Can N,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明:小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatincDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。小鼠canstatinN端片段(1 95aa)与人的同源性为100%。IPTG诱导原核表达载体pET/Can和pET/Can N在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的35%和18%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。文中报道的小鼠canstatin及其N端片段核苷酸序列已收入GenBank,接受号分别为:AY375463和AY502946。

重组人canstatin表达产物的抗肿瘤活性鉴定

目的 正确构建人canstatin原核表达载体 ,诱导表达重组人canstatin融合蛋白 ,并对其活性鉴定。方法 将人canstatincDNA亚克隆入 pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 canstatin ;转化M 15 [pREP4] 中 ,IPTG诱导表达 ,纯化回收表达产物 ,复性后用Lewis肺癌移植瘤模型对其活性鉴定。结果 成功构建人canstatincDNA表达载体 ,纯化回收 ,获得高纯度canstatin重组蛋白。纯化产物在体内能抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移 ,抑瘤率 (% )为 6 0 .0 % ,转移抑制率 (% )为 74 .3%。结论 (1)成功构建了原核表达载体 pQE30 canstatin。 (2 )重组人canstatin融合蛋白在原核表达系统中高水平表达 ,并获得高纯度canstatin重组蛋白。 (3)重组canstatin融合蛋白可抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移活性。

重组小鼠canstatin N端片段对鸡胚新生血管生成的抑制作用(英文)

为了研究重组小鼠canstatinN端片段的体内抗血管生成活性 ,通过PCR扩增小鼠canstatinN端片段cDNA ,定向克隆于原核表达载体 pET30a (+)中 ,构建小鼠canstatinN端片段重组表达载体 pET mCanN ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹检测小鼠canstatinN端片段的表达 .结果表明 ,IPTG诱导原核表达载体 pET mCanN在大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)中高效表达 ,小鼠canstatinN端片段表达量约占菌体总蛋白量的 18% ,小鼠canstatinN端片段主要以包涵体形式存在 ,包涵体经过洗涤、裂解、Ni spincolumn亲合柱层析以及蛋白质复性等步骤纯化后 ,获得了纯度约为 92 %的重组小鼠canstatinN端片段 .鸡胚绒毛尿囊膜 (chickenembryochoriollantoicmembrane ,CAM)实验表明 ,原核表达的小鼠canstatinN端片段能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成 .

结肠癌组织中canstatin基因的表达

目的观察canstatin基因在结肠癌组织中的表达及意义。方法采用RT-PCR检测40例结肠癌癌组织、相应的癌旁组织和远癌组织中canstatin mRNA的表达情况。PCR产物经凝胶电泳,比较各组织中canstatin与GAPDH条带的灰度值之比,半定量分析canstatin mRNA的表达水平。结果癌组织中canstatin mRNA表达水平(0.47±0.14)低于癌旁组织(0.58±0.18)和远癌组织(0.62±0.21);随着肿瘤分化程度的升高,canstatin mRNA在癌组织中的表达也增加(P<0.05),但canstatin mRNA表达与结肠癌临床分期(TNM)、淋巴结转移和病理类型均无统计学差异(P>0.05)。结论canstatin mRNA在结肠癌组织中低表达,说明can-statin基因在结肠癌的发生发展中可能发挥重要作用。

血管生成抑制剂Canstatin研究概况

人血管能抑素Canstatin是近年发现的血管生成抑制剂,具有强大的抑制血管生成作用。本文综述了该药的发现命名、生物学效应、作用机制、应用前景。

血管生成抑制素canstatin的新发现

AIM: As a human basement membrane-derived inhibitor of angiogenesis and tumor growth, canstatin has been paid great attention since it was isolated and identified in 2000. Canstatin significantly inhibited human endothelial cell migration and proliferation and induced apoptosis, suggesting that it might be a powerful and potential therapeutic molecule for atherosclerosis,unstable angina and tumor.

As_2O_3联合重组canstatin蛋白对体外肿瘤血管内皮细胞的影响

目的探讨As2O3联合canstatin蛋白对肿瘤血管内皮细胞(Td-EC)增殖、迁移、血管形成的影响及其凋亡的机制。方法用肝癌HepG2细胞上清诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)成为Td-EC。As2O3联合canstatin干预Td-EC,通过细胞迁移,流式细胞术,观察血管形成。结果 As2O3、canstatin及联合影响Td-EC迁移细胞数分别为32.60±1.51、26.60±1.14、21.00±1.87,显著低于对照组50.60±2.30(P<0.01),并促进凋亡、抑制管腔形成,以联合应用更显著。结论 As2O3联合canstatin在体外可特异地抑制Td-EC增殖、迁移、血管形成及其凋亡。

腺病毒介导canstatin基因对肝癌的抑制作用

目的:探讨人canstatin基因对人肝癌移植瘤模型的抑制作用.方法:应用人肝癌细胞株SMMC-7721建立移植瘤模型.将裸鼠随机分成PBS组、空载体组和载体治疗组(腺病毒载体AdCan),两次注射.治疗期间测量皮下移植瘤的长径和短径;30d后处死裸鼠,取肿瘤行常规病理切片,观察肿瘤组织坏死情况;检测肿瘤组织中caspase-3,Flk-1的表达.结果:完成注射治疗后第3日,AdCan基因治疗组肿瘤体积显著小于其余两组;治疗期间,HE染色显示AdCan基因治疗组坏死最明显;AdCan基因治疗组caspase-3表达高于空载体组和对照组;canstatin基因治疗组Flk-1的表达低于空载体组和对照组.结论:人canstatin基因对肝癌移植瘤的生长具有抑制作用,作用机制可能是降低Flk-1的表达进而抑制肿瘤的血管生成,抑制肿瘤的生长.

人canstatin基因克隆及其重组蛋白的表达和纯化

目的克隆人血管能抑素canstatin基因,构建其原核表达载体,表达并纯化出canstatin蛋白。方法从人胎盘组织中提取总RNA,经RTPCR扩增出canstatin基因,克隆进质粒pUCmT,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET22b(+)相应位点,转化E.coliBL21,IPTG诱导蛋白表达。超声破碎菌体,NiNTA柱亲和层析纯化重组蛋白。结果从人胎盘组织中提取总RNA,显示3条清晰条带,分别对应28S,18S,5S,分光光度计法测得总RNA浓度为1.8g/L;RTPCR扩增出与预期目的基因canstatin长度一致的cDNA片段;构建出克隆质粒pUCmT/canstatin,基因测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致;构建出表达质粒pET22b(+)/canstatin,BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实构建正确;IPTG诱导蛋白表达,SDSPAGE电泳分析表明在相对分子质量24kD左右出现新的蛋白表达条带,诱导后1h、2h、3h、4h表达蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为18.2%、18.8%、23.0%和23.4%;诱导3h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,125、250mmol/L咪唑洗脱液SDSPAGE电泳显示出清晰的单一条带。结论成功克隆出canstatin基因,成功构建了其原核表达载体,并且成功表达、纯化出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础。

重组Canstatin蛋白联合氟尿嘧啶治疗裸鼠结肠癌移植瘤的实验研究

目的探讨血管生成抑制剂Canstatin与细胞毒药物氟尿嘧啶（5-FU）联合应用治疗结肠癌的效果,以期探索结肠癌治疗新途径。方法结肠癌SW-480细胞（1×107/只）注射到30只裸鼠皮下,建立结肠癌皮下移植瘤模型。当肿瘤长至2--3 mm时,随机分6组。给药途径均为腹腔注射给药。治疗期间,定期用圆规和游标卡尺测量皮下移植瘤大小。疗程结束时,取下瘤体,常规病理切片,观察药物毒性反应,CD31免疫组化染色,检测肿瘤内微血管密度（MVD）。结果①各试验组肿瘤的生长明显受到抑制,瘤体质量明显低于对照组（P〈0.01）。5-FU＋Canstatin组低、高浓度联合治疗组抑瘤作用较对照组明显增强（P〈0.05）,其瘤重抑制率分别为74.76%和82.04%。②免疫组化：5-FU＋Canstatin组低浓度组（22.6±3.6）和5-FU＋Canstatin组高浓度组（15.0±2.8）治疗小鼠肿瘤组织内MVD显著低于对照组（36.4±5.6）和5-FU治疗组（31.2±4.0）（P〈0.05）,而5-FU治疗组与对照组间差异无统计学意义;③不良反应：各实验组未观察到明显毒性反应。结论重组人Canstatin蛋白能有效抑制人结肠癌生长,无明显毒副作用,为结肠癌治疗提供了新的有力的治疗方法。

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatin C端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin C端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET/ mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatin C端片段的cDNA 长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatin C端片段氨基酸的同源性为61%。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E.coli BL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatin C端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达。小鼠canstatin C端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。

人血管生成抑制因子canstatin原核表达载体的构建及表达

目的 :构建国人血管生成抑制因子canstatin的原核表达载体并在大肠杆菌BL2 1中表达canstatin重组蛋白。方法 :用Trizol试剂提取人肝脏组织总RNA ,通过RT -PCR扩增canstatin的cDNA ,克隆到pMD1 8-T载体中并进行序列分析。将canstatincDNA定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中 ,而后在大肠杆菌BL2 1中经IPTG诱导表达。结果 :canstatincDNA克隆入质粒pET30a(+)获得了重组表达载体pET30a(+) /Cans,canstatin的cDNA长度为 6 84bp ,编码 2 2 7个氨基酸。IPTG诱导原核表达载体pET30a(+) /Cans在大肠杆菌BL2 1中的表达量约占菌体总蛋白量的 35 %。结论 :原核表达载体pET30a(+) /hCans在大肠杆菌BL2

人canstatin基因的克隆及序列分析

目的 克隆人的canstatin基因并进行序列分析。方法 从人引产死胎肝组织提取总RNA ,以此为模板应用RT PCR法克隆canstatin该基因片段。结果 所得基因片段DNA序列分析由 6 84个碱基组成。

人canstatin基因转化新型生物反应器——杜氏盐藻(Dunaliella salina)的初步研究

采用RT-PCR技术从人的胎盘组织中克隆canstatin基因,定向连接到表达载体pUΩ上,然后与筛选标记bar盒连接得到真核表达载体pU Ω-Can-Bar。采用玻璃珠转化法将该表达载体转化杜氏盐藻(以下简称盐藻),通过草丁膦固体平板筛选得到转化株,进而对转化株进行阳性鉴定。PCR结果显示,在盐藻转化株中均能够扩增出约700 bp特异的条带,而在阴性对照中没有扩增出该条带。Southern blot结果进一步证明人canstatin基因已经整合到盐藻细胞的基因组中。此外,对盐藻转化株的遗传稳定性进行了分析,结果表明canstatin基因能够在转化藻株中稳定遗传。人canstatin转基因盐藻株的成功制备为利用盐藻反应器大规模生产人canstatin蛋白提供了实验依据,为及早实现canstatin蛋白在治疗肿瘤上的临床应用提供了前期工作基础。