阴道上皮细胞的抗念珠菌作用及雌激素对此的影响

目的 :研究阴道上皮细胞对白色念珠菌生长的抑制作用及雌激素对此作用的影响。方法 :用酶消化法分别分离雌激素处理组、动情间期组和去势组小鼠阴道上皮细胞作为效应细胞 ,白色念珠菌芽生孢子作为靶细胞 ,将效靶细胞共同孵育 9h ,测定白色念珠菌生长抑制率 ,观察其生长密度及透射电镜下超微结构的改变。结果 :白色念珠菌与阴道上皮细胞共同孵育后 ,生长受到抑制 ,生长密度降低 ,超微结构表现为与阴道上皮细胞靠近的念珠菌细胞壁崩解 ,细胞膜连续性破坏 ,甚至细胞器肿胀溶解。雌激素处理组与去势组和动情间期组比较 ,阴道上皮细胞对念珠菌的生长抑制率降低 (P <0 .0 5 )。结论 :小鼠阴道上皮细胞具有天然的抗白色念珠菌作用 ,雌激素能降低此抑制作用。

对不同的卵巢上皮性腺癌细胞株建立裸鼠动物模型的实验研究

目的 :探讨卵巢上皮性腺癌细胞株建立裸鼠动物模型的最佳方案。 方法 :采用两种卵巢上皮性腺癌细胞株CAOV3(贴壁细胞 )、COC2 (悬浮细胞 )对裸鼠进行不同细胞密度皮下接种及不同方法的组织块接种。 结果 :在 5× 10 6/ (0 .2 0ml·只 )到 6× 10 7/ (0 .2 0ml·只 )细胞浓度内 ,两株细胞的成瘤率及肿瘤成形时间与接种细胞量无关。与COC2细胞株相比 ,CAOV3成瘤早 (以组织块接种者为甚 ) ,成瘤率高 ,成瘤后生长缓慢。而COC2细胞株一旦成瘤 ,则肿瘤生长速度极快 ,以至于实验尚未完成荷瘤鼠已死亡。 结论 :在建立卵巢上皮性腺癌裸鼠动物模型的实验中 ,以选用贴壁细胞株。

丹槐银屑浓缩丸对小鼠银屑病模型的病理实验研究

目的验证丹槐银屑浓缩丸的药效,为其临床应用提供试验依据。方法采用小鼠阴道上皮细胞有丝分裂模型、尾部鳞片表皮模型,观察丹槐银屑浓缩丸对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂及尾部鳞片表皮细胞分化的影响。结果丹槐银屑浓缩丸能显著抑制小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂,促进小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成。结论丹槐银屑浓缩丸具有抑制银屑病小鼠模型阴道上皮有丝分裂,促使小鼠动物模型尾部鳞片颗粒层形成的作用。

甘露糖结合受体在阴道上皮细胞抗念珠菌中的作用

目的:研究小鼠阴道上皮细胞抗念珠菌的作用机制。方法:用酶消化法将动情间期C57小鼠阴道分离成单个阴道上皮细胞,用流式细胞术及3H-葡萄糖液闪计数法研究甘露聚糖、高碘酸及钙离子螯合剂EGTA对阴道上皮细胞与白色念珠菌粘附及阴道上皮细胞抗白色念珠菌作用的影响。结果:甘露聚糖组(3mg/ml)阴道上皮细胞与白色念珠菌的粘附率为(4.47±1.89)%,显著低于对照组的(14.16±2.17)%(P<0.05),阴道上皮细胞对白色念珠菌生长抑制率为(43.29±9.79)%,高于对照组的(34.81±10.02)%,但差异无显著性(P>0.05);高碘酸组粘附率为(12.27±2.17)%,与对照组的差异无显著性(P>0.05),抑制率为(2.2±2.07)%,显著低于对照组(P<0.05);EGTA组粘附率为(0.4±0.29)%,抑制率为(1.6±1.53)%,均明显低于对照组(P<0.05)。结论:小鼠阴道上皮细胞表面的甘露糖结合受体介导了与白色念珠菌之间的粘附,此受体蛋白上的糖链可能参与了阴道上皮细胞的抗白色念珠菌作用。

去势雄性小鼠泪膜功能异常及角膜上皮细胞超微结构改变

背景体内雄性激素水平的下降对睑板腺与泪腺上皮细胞的分泌功能产生不利影响，导致泪膜质与量的异常，但与泪膜稳定性密切相关的黏蛋白层是否受雄激素水平下降的影响尚不清楚。目的探讨去势手术对雄性小鼠泪膜功能及角膜上皮细胞超微结构的影响。方法采用随机数字表法将56只SPF成年BALB／c雄性小鼠分为正常对照组、伪手术组、和去势术后1、2、4、6、8周组，各手术组小鼠均实施双侧睾丸摘除术，伪手术组小鼠仅切开局部组织而不摘出睾丸。分别于术前和术后1、2、4、6、8周采集各组小鼠外周血样本，采用竞争放射免疫法检测血清睾酮的质量浓度。各组小鼠干眼功能相关检查包括采用酚红棉线法检测泪液分泌功能，检测泪膜破裂时间（BUT）及角膜荧光素染色评分。根据分组于相应时间点颈椎脱臼法处死各组小鼠后收集其角膜组织，透射电子显微镜下观察小鼠角膜上皮组织超微结构的变化。结果正常对照组、伪手术组血清睾酮质量浓度分别为（573．87±6．74）ng/μl和（579．74±8．24）ng/μl，组间差异无统计学意义（t=1．432，P=0．251），但各手术组小鼠血清睾酮质量浓度均为0ng/μl。正常对照组、伪手术组及去势术后1、2、4、6、8周组小鼠泪液分泌量分别为（5．26±0．99）、（4．89±0．56）、（4．62±0．83）、（4．28±0．63）、（3．36±0．56）、（2．60±0．27）和（2．08±0．35）mm／5min，其中术后2、4、6、8周组小鼠泪液分泌量均明显低于正常对照组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）；正常对照组、伪手术组及去势术后1、2、4、6、8周组小鼠BUT分别为（68．33±12．86）、（62．47±3．75）、（58．67±10．03）、（47．17±7．64）、（39．51±3．39）、（32．67±3．88）和（31．00±2．36）s，其中术后2、4、6、8周组小鼠泪液BUT较正常对照组均明显缩短，差异均有统计学意义（均P〈0．05）；小鼠角膜荧光素染色评分随术后时间的延长逐渐增加。透射电子显微镜下可见手术组小鼠角膜上皮细胞微绒毛数量减少、变短和肿胀，细胞间桥粒连接分离。结论去势小鼠血清雄激素水平骤降，小鼠泪液量分泌减少，泪膜稳定性下降，角膜上皮细胞结构损坏，与人类干眼的临床表现吻合。

雌激素对小鼠阴道上皮细胞C-型凝集素表达的影响

目的:探讨雌激素增加假丝酵母菌阴道定植量的分子机制。方法:用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测雌激素组、去势组、动情间期组C57BL/6J雌性清洁级小鼠阴道上皮层中C-型凝集素mRNA的表达。结果:雌激素组及动情间期组小鼠阴道上皮层中均检测到C-型凝集素mRNA的表达,雌激素组相对表达量(1.02±0.16)显著高于动情间期组(0.71±0.57)(P<0.05)。去势组未检测到C-型凝集素mRNA的表达。结论:雌激素可能上调C-型凝集素在阴道上皮细胞的表达。

小鼠HSV-2阴道炎粘膜上皮细胞凋亡和Fas/FasL异常表达关系的研究

目的 :探讨 HSV- 2在体内诱导细胞凋亡的效果、形态学特点和 Fas蛋白的表达。方法 :用 HSV- 2 333株感染小鼠阴道 ,光镜下进行原位观察 ,TUNEL末端标记染色显示凋亡的细胞 ,免疫组化技术检测 Fas蛋白的表达。结果 :感染后的第 1天粘膜上皮内即出现大量的凋亡细胞 ,第 3～ 6天凋亡细胞的数量及在上皮内的分布范围达最高水平。凋亡细胞被 TUNEL标记染成棕褐色 ,经免疫组化技术证实凋亡细胞有 Fas蛋白的表达。结论 :HSV- 2 333株阴道感染可同时诱导细胞坏死及凋亡 ,Fas蛋白的表达参与了细胞凋亡的发生。

红芸豆植物凝集素长期阴道给药对小鼠阴道上皮细胞的影响

目的:观察长期阴道使用红芸豆植物凝集素(RKBL)对小鼠阴道上皮细胞的影响。方法:使用不同浓度的RKBL注入小鼠阴道连续给药4个月后断颈处死小鼠,取其阴道及周围组织,制作石蜡切片并经苏木精染色,显微镜下观察阴道组织的形态学变化。结果:小鼠阴道在浓度≤2.5mg/只的RKBL处理后,无炎症病变,阴道粘膜上皮细胞形态完好无破损,皮下组织形态正常。而当给药浓度提高到5mg/只时,阴道黏膜浅层上皮细胞出现空泡化。结论:浓度≤2.5mg/只的RKBL长期使用不会引起阴道黏膜上皮细胞及皮下组织的不良反应。

胸腺基质淋巴细胞生成素和白细胞介素-4在变应性结膜炎鼠模型中的促炎作用

背景研究表明胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）为类白细胞介素（IL）-17的炎性细胞因子，在多种变应性疾病的发生和发展中发挥关键作用，但是尚未见到关于TSLP是否参与中国常见变应原诱导的变应性结膜炎的报道。目的研究TSLP和IL-4在由中国常见的黄花蒿诱导的变应性结膜炎小鼠模型眼表组织和颈部淋巴结中的表达变化，探讨TSLP和IL-4在变应性结膜炎发病中的作用。方法采用随机数字表法将6-8周龄雌性BALB／c小鼠20只随机分为正常对照组和模型组。将400μl黄花蒿花粉提取液溶解于400μl变应原（抗原）溶媒中制备成抗原溶液，将50μl抗原溶液注射于模型组小鼠足底皮垫下初次致敏，于注射后第10-12天用黄花蒿花粉提取液局部点右眼再次致敏，每日点眼1次；正常对照组小鼠未做任何处理。于造模后第13天采用颈椎脱臼法处死小鼠并摘取眼球，在眼科显微镜下各组分别取16只小鼠32只眼角膜上皮、结膜和颈部淋巴结组织，采用实时定量PCR法检测各种靶组织中TSLP mRNA及IL-4 mRNA的相对表达量，另每组各取4只小鼠8只眼眼睑及眼球制备石蜡切片，采用免疫组织化学法检测角膜、结膜及结膜下组织中TSLP和IL-4蛋白的表达。结果模型组小鼠第2次致敏后0．5h可见小鼠眼睑水肿、结膜充血水肿、溢泪、搔抓眼睑等症状，症状持续6-24h，造模成功率为80％。实时定量PCR结果显示，模型组与正常对照组小鼠角膜上皮均未发现IL-4表达。模型组小鼠角膜上皮、结膜组织和颈部淋巴结组织中TSLP mRNA表达量分别是正常对照组的（1．63±0．20）、（2．71±0．48）和（1．48±0．05）倍，差异均有统计学意义（t=4．44、14．16、5．01，均P〈0．05）；模型组小鼠结膜和颈部淋巴结中IL4mRNA表达量分别是正常对照组的（2．94±0．39）倍和（1．74±0．09）倍，差异均有统计学意义（t=9．92、14．54，均P〈0．05）。免疫组织化学法检测显示，正常对照组小鼠角膜上皮和结膜上皮细胞中TSLP蛋白表达强度微弱，模型组小鼠TSLP蛋白表达增强。模型组小鼠结膜下组织中可见IL4呈强阳性表达，正常对照组小鼠结膜下组织中未发现IL4表达。结论TSLP主要表达于变应性结膜炎小鼠的角膜、结膜和颈部淋巴结组织，提示其参与变应性结膜炎角膜和结膜的炎症反应；IL-4主要表达于变应性结膜炎小鼠结膜下组织中，提示其主要参与结膜的炎症反应，TSLP和IL-4共同参与变应性结膜炎的发生和发展过程，这2种炎症因子为变应性结膜炎的临床治疗提供了新的靶点。

胸腺上皮细胞可植入异基因骨髓移植小鼠胸腺并促进T淋巴细胞数量重建

目的 通过建立异基因骨髓移植（BMT）联合胸腺上皮细胞移植（TCT）小鼠模型,探讨TCT应用于BMT的可行性及其效应.方法 以BALB/C小鼠为受鼠,C57BL/6小鼠为供鼠,移植前1d对受鼠进行全身照射预处理,BMT后取C57BL/6孕鼠胚胎期14～16 d胎胸腺上皮细胞进行TCT.为了分析合适的全身照射剂量,将接受不同全身照射剂量的受鼠分为3组：7 Gy组、6.5 Gy组和6 Gy组.为了分析胸腺上皮细胞植入情况,以接受BMT联合供鼠来源TCT的受鼠作为实验组,以单纯接受BMT的受鼠作为对照组,每组8只.采用活体成像检测分析胸腺上皮细胞植入情况,测定胸腺指数,取各组受鼠胸腺进行组织学检查及观察胸腺上皮细胞表面标记分子K8、K5免疫荧光抗体染色情况,应用流式细胞仪检测各组受鼠移植4周后外周血T淋巴细胞亚群.结果 接受6.0 Gy剂量的受鼠能够长期存活但植入失败,照射剂量6.5 Gy时受鼠的存活率降低但BMT和TCT皆植入成功,表明6.5 Gy是最小致死剂量,作为建立模型的全身放疗剂量.活体成像检测显示,移植后2周实验组受鼠前胸部皮下可检测到明显的荧光信号,对照组受鼠未检测到任何荧光.移植4周,实验组受鼠的胸腺单叶明显比对照组单叶体积大,且胸腺指数也较高.组织学观察显示,嵌合了异基因TEC的受鼠胸腺具有典型的胸腺皮质和髓质结构,且明显表达K8＋和K5＋胸腺髓质上皮细胞.移植4周后,实验组CD4＋和CD8＋T淋巴细胞比例均明显高于对照组（P＜0.05）.结论 胸腺上皮细胞可植入异基因BMT受鼠胸腺内,并促进受鼠外周免疫T淋巴细胞数量的重建.

新生小鼠肠道类器官的发育成熟过程

目的探究新生小鼠肠道类器官的发育成熟过程,为围产期胎儿/新生儿肠道上皮发育及相关疾病的研究提供新模型。方法取3日龄C57BL/6小鼠肠道组织,利用标准条件培养肠道类器官,传代培养至第5代。利用倒置相差显微镜观察并记录各代肠道类器官形态变化。利用实时荧光定量聚合酶链反应和免疫荧光技术检测各代肠道类器官中肠道干细胞及肠道上皮各类型分化细胞标志物的表达及组织细胞定位(选取的标志基因:肠道干细胞:Lgr5;胎儿期肠道祖细胞:Tpm2和Gja1;肠道上皮细胞:Villin;帕内特细胞:Lyz1;杯状细胞:Muc2;内分泌细胞:Chga;选取的各细胞标志蛋白:肠上皮细胞:绒毛蛋白;杯状细胞:黏蛋白2;内分泌细胞:嗜铬粒蛋白A;帕内特细胞:溶菌酶)。采用单因素方差分析和Bonferroni检验进行统计学分析。结果新生小鼠肠道类器官中存在不成熟的球状体和具有隐窝-绒毛结构的成熟型类器官这2种类型。原代培养物中以球状体为主要形态,占(96.61±1.36)%;从原代至传代第2代间,类器官形态变化表现为球状体比例明显下降[第2代占比下降至(8.93±1.50)%],且面积缩小(F=12.88,P<0.001);第2代至第5代类器官的形态以成熟类器官为主,占比从(91.07±1.50)%升至(95.56±2.14)%。肠道干细胞标志基因Lgr5的表达在从原代传代到第2代之间降低(F=76.75,P<0.001),第2代Lgr5表达为原代的0.40±0.06,在第2代之后上升。胎儿期肠道祖细胞标志基因Tpm2表达在传代中明显下降(原代1.00±0.11,第5代0.003±0.001,F=148.00,P<0.001);Gja1的表达在原代(1.00±0.14)至第2代(0.06±0.04)间下降(F=197.10,P<0.001),在第2代后保持稳定低表达(F=2.20,P=0.13)。肠道上皮内各类型分化细胞(肠上皮细胞、杯状细胞、内分泌细胞和帕内特细胞)的标志基因表达在传代第2代之后呈现升高趋势(Villin:第2代0.46±0.11,第5代1.02±0.05;Muc2:第2代0.68±0.29,第5代8.79±0.61;Chga:第2代2.53±0.16,第5代4.32±0.45;Lyz1:第2代0.98±0.21,第5代3.81±0.36;P值均<0.05)。免疫荧光染色结果显示,在原代及第5代培养物中,肠上皮细胞标志蛋白绒毛蛋白均沿肠道类器官绒毛侧分布。杯状细胞标志蛋白黏蛋白2及内分泌细胞标志蛋白嗜铬粒蛋白A在原代中表达很低,而到第5代中染色明显。在原代培养物中帕内特细胞标志蛋白溶菌酶弥散性均匀分布在类器官细胞内,而在第5代中可见高荧光强度点状表达。结论新生小鼠肠道类器官的连续培养可模拟未成熟肠道上皮的发育成熟过程。原代至传代第2代类器官也许可作为胎儿至新生儿期肠道上皮发育的研究模型,传代第2~5代类器官也许可作为新生儿期肠道疾病研究的新模型。

环状RNA hsa-circ-0006361对卵巢癌SKOV3细胞小鼠移植瘤生长的影响

目的:基于前期RNA-seq测序发现hsa-circ-0006361在卵巢癌中高表达,为研究hsa-circ-0006361在上皮性卵巢癌发生发展中的作用,我们研究了hsa-circ-0006361对人上皮性卵巢癌裸鼠移植瘤生长、裸鼠生存时间的影响。方法:分离细胞核与细胞质后分别提取RNA进行RT-qPCR及琼脂糖凝胶电泳分析,验证hsa-circ-0006361为环状RNA并确定其亚细胞定位。构建hsa-circ-0006361表达载体,转染SKOV3卵巢癌细胞后通过G418筛选得到hsa-circ-0006361稳定表达及空载体circ-vector298卵巢癌细胞株。通过小鼠皮下注射上述卵巢癌细胞建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型,评价hsa-circ-0006361表达对卵巢癌细胞移植瘤生长及裸鼠存活时间的影响。结果:hsa-circ-0006361是主要分布在细胞质的环状RNA。hsa-circ-0006361过表达细胞株组裸鼠皮下移植瘤生长与circ-vector298组相比,从接种后第12天开始生长速度明显加快(P<0.05),而hsa-circ-0006361实验组小鼠体重相比circ-vector298对照组,第9天起体重明显更轻(P<0.05),并且实验组小鼠存活时间明显缩短(P<0.05)。结论:hsa-circ-0006361是主要分布在细胞浆的环状RNA,其在卵巢癌中高表达并促进卵巢癌小鼠移植瘤的生长与腹腔转移,缩短荷瘤小鼠生存时间。