RNA干涉抑制宫颈癌CaSki细胞株HPV16 E6基因的研究

背景与目的:研究表明宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)E6、E7癌基因密切相关,于是人们采用核酶或HPVE6、E7反义寡核苷酸抑制其表达来治疗宫颈癌,虽然取得了一定的效果,但仍面临基因抑制效率低、维持时间短、工作量大、耗费多等问题。本研究采用最新的RNA干扰技术干扰宫颈癌CaSki细胞中HPV16E6转录,以了解其能否特异性抑制HPV16E6基因及其时效性如何。方法:设计合成针对HPV16E6的荧光标记siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过荧光照片计数荧光细胞占所有细胞的比例计算转染效率;测定转染后不同时间点的细胞凋亡率;RT-PCR测定HPV16E6mRNA变化,Westernblot和流式细胞仪检测转染前后蛋白表达情况。结果:相差显微镜荧光照片显示细胞转染的效率为81%。HPV16E6siRNA转染细胞后24h、48h、5天凋亡率分别为7.7%、11.8%和37.4%,转染9天时凋亡率下降至12.6%。RT-PCR扩增结果显示,细胞转染前HPV16E6mRNA的量与siRNA阴性对照比较没有显著性差异,但转染后24h、48h、5天和9天分别减少了77%、83%、59%和41%;而作为内对照的β-actinmRNA在转染前后无变化。流式细胞仪定量测定HPV16E6蛋白,结果显示转染后24h、48h和5天,蛋白表达抑制率分别为79.7%、80.4%和71.3%;9天时抑制率有下降,但仍可达57.

莪术醇对人宫颈癌CASKI细胞增殖抑制及促凋亡作用的研究

目的:探讨莪术醇对人宫颈癌CASKI细胞体外增殖和凋亡的影响。方法:12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml不同浓度莪术醇作用于人宫颈癌CASKI细胞后,MTT法检测CASKI细胞的增殖抑制率;流式细胞仪分析细胞周期分布及细胞凋亡率变化;电镜观察肿瘤细胞凋亡的形态学特征。结果:12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的莪术醇对宫颈癌CASKI细胞均有不同程度的增殖抑制作用,在一定范围内,具有浓度-时间依赖性。流式细胞仪分析结果显示:50μg/ml、100μg/ml莪术醇作用于宫颈癌CASKI细胞24h,可阻滞细胞周期于G2/M期,并诱导部分细胞凋亡。电镜下可见凋亡细胞及凋亡小体,且100μg/ml组细胞凋亡改变较50μg/ml组更明显。结论:莪术醇能明显抑制CASKI细胞的体外增殖,且可阻滞CASKI细胞周期于G2/M期并诱导细胞凋亡。

南赤瓟醇提物通过PI3K/Akt/mTOR信号通路促进人宫颈癌Caski细胞凋亡

目的:研究南赤瓟醇提物影响PI3K/Akt/m TOR信号通路促进人宫颈癌Caski细胞凋亡的作用机制。方法:用南赤瓟醇提物(0.062 5、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/m L)作用Caski细胞24 h后,检测其对细胞增殖的影响;然后用南赤瓟醇提物(0.25、0.50和1.00 mg/m L)作用Caski细胞24 h后,流式细胞术测定细胞周期DNA含量及亚G_1凋亡峰,ELISA试剂盒检测Caski细胞中Caspase-9和Caspase-3活性及线粒体和胞浆中细胞色素C(Cyt C)含量,Real-time PCR测定P53、Bcl-2和Bax m RNA表达,并计算Bcl-2/Bax比值,Western blot测定PI3K、Akt、m TOR磷酸化水平(p-PI3K、p-Akt、p-m TOR),并计算p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR比值。结果:南赤瓟醇提物对Caski细胞生长抑制作用呈明显的剂量依赖性;南赤瓟醇提物(0.25、0.50和1.00 mg/m L)能显著抑制Caski细胞增殖,并将其阻滞于G_2/M期;可抑制pPI3K、p-Akt和p-m TOR蛋白表达水平,降低pPI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR比值;上调P53和Bax m RNA表达,下调Bcl-2 m RNA及Bcl-2与Bax比值;降低线粒体中Cyt C含量,升高胞浆中Cyt C含量;增强Caspase-9和Caspase-3活性(P<0.05,P<0.01)。结论:南赤瓟醇提物诱导Caski细胞凋亡的作用机制与抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路磷酸化有关。

阿司匹林诱导人宫颈癌Caski细胞凋亡及其分子机制

目的探讨阿司匹林对人宫颈癌Caski细胞体外增殖抑制作用及机制,为其用于宫颈癌的临床治疗提供依据。方法体外培养Caski细胞,分别以1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mmol/L阿司匹林干预。采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率;流式细胞仪测定细胞周期时相改变及细胞凋亡率;琼脂糖电泳法观察凋亡细胞DNA Ladder现象;Western blot法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡相关基因表达。结果阿司匹林干预后Caski细胞增殖明显受抑,且呈时间和剂量依赖性;Caski细胞G0/G1期和G2/M期比例明显下降,S期比例升高;细胞凋亡率明显升高;Bcl-2表达量减少,Bax表达增加,Caspase-3活化。结论阿司匹林在体外可抑制人宫颈癌Caski细胞增殖,其机制可能为抑制肿瘤细胞DNA合成,改变其细胞周期时相分布,诱导其凋亡。

过表达β联蛋白和T细胞因子抑制物(ICAT)促进人宫颈癌Caski细胞的增殖和迁移

目的探讨β联蛋白和T细胞因子抑制物(ICAT)的高表达对人宫颈癌Caski细胞增殖和迁移的影响。方法含ICAT基因腺病毒(Ad ICAT)感染Caski细胞,采用实时定量PCR检测ICAT mRNA水平,Western blot法检测ICAT蛋白水平;MTT法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,TranswellTM小室迁移实验检测细胞迁移能力。结果 Ad ICAT感染后,Caski细胞的ICAT mRNA和蛋白水平均显著增加;过表达ICAT后,促进Caski细胞的增殖,S期细胞比例明显增加,细胞迁移能力增强。结论 Caski细胞过表达ICAT后,促进其增殖和迁移。

不同温度热疗对宫颈癌Caski细胞坏死和凋亡的分析

目的探讨不同温度热疗对宫颈癌Caski细胞坏死和凋亡的影响。方法采用水浴对宫颈癌Caski细胞行43℃,45℃,47℃实验组和37℃对照组热疗,四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡和坏死率,免疫组化检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达。结果45℃,47℃组的细胞增殖抑制率在24h、48h、72h、96h分别为76.11%±5.32%、81.08%±4.03%、74.71%±3.78%、72.16%±4.75%和88.57%±3.77%、91.33%±2.43%、91.09%±1.17%、92.05%±1.67%,明显高于43℃组的26.57%±3.46%、25.49%±2.76%、22.80%±3.16%、26.87%±4.01%(q=10.41,18.23,14.53,13.57,P<0.05;q=14.41,21.62,16.03,16.01,P<0.05)。45℃与47℃组细胞增殖抑制率在24h、72h、96h的差异无显著性(q=3.01,1.49,2.44,P>0.05)。45℃组的细胞凋亡率最高,为12.82%±1.77%,与其他各组之间的差异具有显著性(F=18.69,P<0.05)。47℃组的细胞坏死率最高,为39.15%±5.67%,各组之间的差异均有显著性(F=69.16,P<0.05)。PCNA的表达随着温度的增加而降低,45℃,47℃组的平均光密度值(average optical density,AOD)分别是0.22±0.02、0.21±0.01,与37℃对照组0.28±0.02相比差异具有显著性(q=4.75,5.76,P<0.05)。结论45℃及以上的热疗能够明显抑制Caski细胞的增殖,增加凋亡和坏死率,降低PCNA的表达。

吉祥草中甾体皂苷RCE-4对人宫颈癌Caski细胞Ras/Erk和p16/cyclinD1/CDK4通路的影响

目的:研究吉祥草中甾体皂苷RCE-4影响Ras/Erk和p16/cyclin D1/CDK4信号通路促进Caski细胞凋亡的作用机制。方法:体外培养人宫颈癌Caski细胞株,用RCE-4作为处理因素,MTT法检测细胞增殖活力;流式细胞术检测细胞周期分布;Real-time PCR检测p16、cyclin D1和CDK4m RNA表达水平;Western blot检测Ras/Erk信号通路总蛋白和磷酸化蛋白表达水平。结果:RCE-4呈剂量依赖性抑制Caski细胞增殖,其作用24 h的IC50值为12.33μmol/L;升高G0/G1期细胞比例,降低S期细胞比例;抑制Ras、p-Raf、p-Mek1/2和p-Erk1/2蛋白表达,降低p-Raf/Raf、p-Mek1/2/Mek1/2和p-Erk1/2/Erk1/2比值,上调p16的m RNA表达,下调cyclin D1和CDK4的m RNA表达。结论:RCE-4可抑制Caski细胞的增殖,诱导细胞在G0/G1期阻滞,其诱导作用与其抑制Ras/Erk和p16/cyclin D1/CDK4信号通路激活有关。

雷公藤内酯醇对人宫颈癌CaSki细胞株的体外作用研究

目的探讨雷公藤内酯醇(TPL)对人宫颈癌CaSki细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT比色法检测不同浓度(0、5、10、20ng/ml)TPL作用24、48、72h后对CaSki细胞增殖的影响,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,细胞免疫化学法检测Ki-67及p53蛋白表达的改变。结果倒置相差显微镜观察可见TPL处理后细胞皱缩变圆变粗糙,体积缩小,且不断地脱落悬浮于培养液中,数量减少,细胞间隙增大,且随药物浓度增加及作用时间延长,这种变化趋于明显。5、10、20ng/ml TPL在体外对CaSki细胞的生长具有抑制作用,且呈剂量、时间依赖方式(P<0.01)。免疫细胞化学检测显示TPL作用后CaSki细胞Ki-67及p53蛋白表达下调,且呈剂量、时间依赖方式(P<0.01)。结论 TPL可抑制CaSki细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与抑制癌细胞Ki-67及p53蛋白表达有关。

维生素C诱导人宫颈癌Caski细胞凋亡及其分子机制的研究

为了研究维生素C对人宫颈癌Caski细胞体外抑制、诱导凋亡的作用及其分子机制,使用不同剂量维生素C处理人宫颈癌Caski细胞,采用噻唑蓝(MTT)法检测药物对细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测Cas-ki细胞周期变化;琼脂糖电泳法观察凋亡细胞DNA Ladder现象;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和E6的表达以及Caspase 3的激活;荧光染色观察细胞线粒体膜电位的改变.分析发现,维生素C可显著抑制人宫颈癌Caski细胞增殖,呈现明显的时间和剂量依赖性;将细胞阻滞于S期;诱导细胞凋亡,下调Bcl-2和E6、上调Bax蛋白表达,促进Caspase3活化,降低线粒体膜电位.表明维生素C在体外可有效抑制人宫颈癌Caski细胞增殖,诱导细胞凋亡.

大鼠CB1基因真核表达载体的构建及其对CaSki细胞凋亡的影响

目的构建大鼠CB1(r CB1)基因真核表达载体,检测r CB1基因在细胞中的表达,研究r CB1对人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的影响。方法从大鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增r CB1基因,通过酶切、纯化、连接PCR纯化产物与p CDNA 3.1(+)质粒,构建pc DNA3.1(+)-r CB1。脂质体法将其转染到HEK293和Ca Ski细胞,Western blot及细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦方法检测r CB1的表达及定位,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot与实时荧光定量PCR检测r CB1、Bcl-2、Bax、Bad表达。结果酶切重组质粒获得5300 bp的载体片段和1500 bp的目的片段,测序结果和r CB1基因序列(NM_012784.4)一致。转染HEK293细胞后,r CB1在HEK293细胞细胞膜和细胞质表达。转染Ca Ski细胞后,r CB1使细胞凋亡率增加(P<0.05);r CB1基因上调Bax、Bad的表达,同时抑制Bcl-2的表达,与空白组比较,其差异具有显著性(P<0.05)。结论成功构建了pc DNA3.1(+)-r CB1真核表达载体,r CB1表达于细胞膜和细胞质,r CB1可以明显促进宫颈癌Ca Ski细胞凋亡,其机制是上调Bax、Bad和抑制Bcl-2表达。

HPV 16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗诱导CTL致CaSki细胞凋亡体外实验研究

目的:采用人乳头状瘤-16(HPV-16)E6E7重组腺病毒(pAd-E6E7)转染树突状细胞(Dendritic cell,DC),观察基因修饰的DC疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)致使CaSki细胞凋亡的效果。方法:将pAd-E6E7转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞制备DC疫苗,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠未成熟树突状细胞绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测转染前后小鼠树突状细胞表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)。DC疫苗诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞,与CaSki细胞共培养后,采用DAPI、TUNEL及流式细胞术检测CaSki细胞凋亡情况。结果:pAd-E6E7成功转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞,体外转染效率约为40%～50%,成功制备了HPV16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗,诱导产生细胞毒性T淋巴细胞,经DAPI、TUNEL及流式细胞术检测证明CaSki出现凋亡。结论:以带有HPV16 E6E7基因的重组腺病毒载体转染DC制备基因修饰的DC疫苗,诱导CTL致使CaSki细胞出现凋亡。

shRNA介导的hWAPL表达沉默对人宫颈癌CaSki细胞增殖与凋亡的影响

目的:为探讨人半翼(hWAPL)蛋白在细胞增殖与凋亡中的作用及其作为分子靶点用于肿瘤治疗的潜在价值,本研究用RNA干扰技术抑制hWAPL基因的表达,并观察了其对人宫颈癌细胞CaSki细胞增殖和细胞凋亡的影响。方法:实时荧光定量PCR和Western blotting检测hWAPL shRNA的干扰效率;MTT检测细胞增殖;Annexin V-PE和Hoechst 33258染色检测细胞凋亡;蛋白质印迹分析凋亡蛋白cleaved caspase-3和细胞周期抑制蛋白p21、p27的表达。裸鼠荷瘤模型体内研究hWAPL沉默对CaSki细胞增殖的影响。结果:实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果表明,筛选到的hWAPL shRNA能有效抑制内源hWAPL的表达。MTT实验表明shRNA介导的hWAPL表达沉默显著抑制CaSki细胞的增殖。Annexin V-PE分析结果表明,hWAPL沉默增加了凋亡细胞数目。细胞核经Hoechst 33258染色出现浓染致密的固缩形态和颗粒状荧光;蛋白质印迹结果显示cleaved caspase-3、p21和p27表达增加;裸鼠成瘤实验表明,hWAPL沉默的肿瘤体积减小,增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达增加。结论:hWAPL沉默抑制CaSki细胞增殖,促进细胞凋亡,是一个潜在的肿瘤治疗新靶点。

带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用

目的:探索带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用。方法:体外诱导培养C57BL/6小鼠骨髓的未成熟DC(immature DC,imDC),将已经成功构建的携带人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)-16 E6/E7基因的重组腺病毒感染imDC,Western blot检测E7蛋白的表达;构建裸鼠的人宫颈癌CaSki细胞移植瘤模型,应用DC疫苗诱导的BALB/c小鼠脾脏的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)处理后,观察裸鼠肿瘤体积变化,肿瘤长出第28天后处死裸鼠,小心剥下肿瘤组织,石蜡包埋,HE染色观察各组肿瘤的细胞形态,免疫组织化学技术法检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。结果:成功培养出DC并制备出DC疫苗;第28天各组裸鼠肿瘤体积pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组与pAd-mock-DC-CTL-CaSki组、DC-CTL-CaSki组、CaSki组相比较,pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组裸鼠肿瘤体积最小(P<0.05);免疫组化检测肿瘤组织中Bax蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最高,而CaSki组表达最低;免疫组化检测肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最低,而CaSki组表达最高。结论:带有HPV-16 E6/E7DC疫苗能够诱导CTL抑制裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的生长。

南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Caski移植瘤的抑制作用

探讨了南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Caski移植瘤的抑制作用,并在此基础上探寻其可能的机制.将0.3mL Caski(4×107个/mL)细胞悬液接种于裸鼠右侧后腿背部皮下,接种2次,间隔时间1周,建立裸鼠宫颈癌Caski移植瘤模型.将移植瘤裸鼠随机分为模型组、南赤瓟醇提物组(200和400mg/kg)组,每组5只,每天给药1次,连续给药4周,停药次日处死裸鼠,测量裸鼠体重、移植瘤体积、瘤重,计算抑瘤率;光镜下观察移植瘤组织形态学变化;Annexin V-FITC/PI染色测定细胞凋亡率,荧光定量PCR测定Bcl-2、Bax和Caspase-3、Caspase-9mRNA表达,并计算Bcl-2与Bax比值.结果表明南赤瓟醇提物可显著降低移植瘤体积和抑瘤率,上调Bax和Caspase-3、Caspase-9mRNA表达,下调Bcl-2mRNA表达和Bcl-2与Bax比值,与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01).南赤瓟醇提取物对人宫颈癌Caski细胞移植瘤生长具有明显抑制作用,其作用机制与调节Bcl-2、Bax和Caspase-3、Caspase-9基因表达有关.

多胺类似物双乙基去甲精胺联合阿司匹林高效杀伤宫颈癌Caski细胞的研究

目的:研究多胺类似物双乙基去甲精胺(BENS)与阿司匹林联用对宫颈癌Caski细胞的生长影响以及可能的细胞学机制。方法:多胺类似物BENS联用阿司匹林孵育体外培养的人宫颈癌Caski细胞,采用四甲基偶氮唑蓝法测定细胞存活率,DNA Ladder以及流式细胞术观察各组细胞周期和凋亡率变化,Western blot检测Bcl-2、Bax和cyt-C凋亡相关基因的表达情况,化学发光法测定精胺氧化酶(SMO)活性。结果:BENS与阿司匹林联用能显著降低单用BENS的细胞存活率(P<0.05),同时低剂量阿司匹林就能显著增强BENS诱导细胞凋亡作用(P<0.01)。联合用药组与单独用药组相比较,细胞G0/G1期比例明显升高,S期和G2/M期比例下降;诱导细胞凋亡发生;胞浆中Bcl-2表达量减少,Bax表达增加,cyt-C由线粒体释放。且SMO活性无明显改变。结论:联用低剂量阿司匹林能有效增强BENS诱导人宫颈癌Caski细胞凋亡的作用,但与多胺代谢过程无关。

阿司匹林对宫颈癌细胞系Caski的生长抑制作用

目的 探讨阿司匹林对宫颈癌细胞系Caski作用。方法 利用细胞计数法对宫颈癌细胞系Caski细胞进行活细胞计数 ,利用流式细胞仪检测细胞DNA含量。结果 阿司匹林对宫颈癌细胞系Caski细胞的抑制呈剂量依赖性 ,在 1- 5mM浓度范围内 ,生长抑制率为 2 0 %～ 86 %。阿司匹林作用后的Caski细胞呈现出G1和G2期细胞数目增加 ,而S期细胞数目减少的趋势。

顺铂诱导人宫颈鳞癌细胞Caski细胞凋亡的分子机制

目的研究顺铂对人宫颈癌Caski细胞体外增殖抑制作用及凋亡的影响,探究顺铂诱导宫颈鳞癌细胞凋亡的分子机制。方法运用体外细胞培养,顺铂以不同浓度(20、10、5、2、1μg/ml)作用于人宫颈癌Caski细胞。采用噻唑蓝(MTT)法测定顺铂对细胞杀伤率;用流式细胞检测法测定细胞周期时相改变及细胞凋亡率;琼脂糖电泳法观察凋亡细胞DNALadder现象;Westernblot检测凋亡相关基因Bcl-2等表达;荧光染色观察细胞线粒体膜电位的改变。结果顺铂对人宫颈癌Caski细胞有较强的抑制作用,有明显的时间和剂量依赖性;可使Caski细胞G2/M期比例明显下降(P<0.01),S期比例升高(P<0.01);诱导细胞凋亡发生;顺铂作用Caski细胞后,Bcl-2表达量减少,Bax表达增加,Caspase3活化,线粒体膜电位改变。结论顺铂在体外可有效抑制人宫颈癌Caski细胞增殖,可能通过影响肿瘤细胞DNA合成,改变细胞周期时相分布、诱导凋亡发挥抑制细胞增殖作用,其凋亡分子机制与Bcl-2家族表达调控,线粒体膜跨膜电位下降的线粒体参与凋亡途径相关。

调控细胞分裂周期蛋白6对人类乳头瘤病毒16阳性宫颈癌细胞Caski增殖和凋亡的影响

目的探讨调控细胞分裂周期蛋白6(CDC6)对人类乳头瘤病毒(HPV)16阳性宫颈癌细胞Caski增殖和凋亡的影响。方法检测HPV阴性的宫颈癌C33-A细胞株、HPV16阳性的宫颈癌Caski细胞株和SiHa细胞株、HPV18阳性的宫颈癌HeLa细胞株中CDC6蛋白及mRNA的表达水平。将CDC6小干扰RNA(siRNA)-1、siRNA-2、siRNA-NC分别转染入宫颈癌Caski细胞(分别设为CDC6 siRNA-1组、CDC6 siRNA-2组、siRNA-NC组),并设立空白对照组,24 h和48 h后分别检测各组CDC6 mRNA和蛋白的表达水平,筛选出最佳的siRNA序列。转染后,检测最佳siRNA序列的CDC6 siRNA组、siRNA-NC组、空白对照组的细胞增殖能力、细胞周期及细胞凋亡率。结果(1)Caski细胞、HeLa细胞、SiHa细胞、C33-A细胞的CDC6 mRNA的相对表达量依次降低;C33-A细胞CDC6蛋白的相对表达量低于其他3种细胞,Caski细胞和HeLa细胞CDC6蛋白的相对表达量均高于SiHa细胞(均P<0.05)。(2)CDC6 siRNA-1组CDC6 mRNA及蛋白相对表达量低于CDC6 siRNA-2、siRNA-NC组与空白对照组(均P<0.05),故选用siRNA-1序列进行后续研究。(3)转染48 h后,与siRNA-NC组与空白对照组比较,CDC6 siRNA-1组的细胞增殖能力降低,细胞凋亡率增加,细胞G 1期变长、G 2期缩短(均P<0.05)。结论沉默CDC6能够有效干扰HPV16阳性宫颈癌Caski细胞的增殖,靶向抑制CDC6有望成为早期治疗宫颈癌的新途径。

阳离子卟啉对宫颈癌细胞株Caski的光动力学杀伤效应

目的探讨阳离子卟啉(TMPyP4)对宫颈癌细胞株Caski的光动力学杀伤效果和可能作用机制,为光动力学治疗(PDT)在宫颈癌动物荷瘤模型以及临床应用中提供理论依据。方法以宫颈癌细胞株Caski为研究对象,以TMPyP4为光敏剂,按照不同处理因素分为正常对照组、单纯PDT组、单纯TMPyP4组和TMPyP4-PDT组。采用四甲基偶氮唑蓝法检测TMPyP4-PDT对宫颈癌细胞株Caski体外生长的抑制作用,光镜下观察细胞形态变化。采用Annexin V-PI双标记法检测细胞凋亡率。采用实时荧光定量PCR检测TMPyP4-PDT对Caski细胞Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和NF-κB mRNA表达水平的影响。结果单纯TMPyP4组和TMPyP4-PDT组对细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.01),且呈剂量依赖性;单纯PDT组对细胞增殖的抑制作用不明显(P>0.05)。光镜下可观察到单纯PDT组贴壁细胞多,无核固缩及核碎裂样改变;单纯TMPyP4组及TMPyP4-PDT组细胞出现胞质空泡化、细胞体积缩小、细胞核碎裂及凋亡小体形成等。流式细胞术检测结果显示,TMPyP4-PDT可诱导Caski细胞凋亡,且随着药物浓度的增加,细胞凋亡百分比增加。实时荧光定量PCR检测发现,随着药物浓度的增加,Caski细胞Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和NF-κB mRNA表达水平明显降低,P16 mRNA表达水平升高,与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 TMPyP4-PDT对宫颈癌细胞株Caski有明显的杀伤作用,其机制可能与正性调节P16以及负性调节Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和NF-κB mRNA表达量有关。

短发夹状RNA抑制子宫颈癌CaSki细胞HPV16 E7基因的研究

目的:研究短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)构建的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16 E7 siRNA表达载体转染宫颈癌细胞株CaSki细胞后,在体内外对CaSki细胞E7基因的抑制作用。方法:利用脂质体将构建有HPV16 E7特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的表达载体P1、P2、P3转染CaSki细胞,以实时荧光定量RT- PCR及流式细胞仪检测不同时间点E7 mRNA和蛋白的变化,并将载体P1转染后的细胞接种到裸鼠皮下,4周后观察裸鼠体内皮下移植瘤体积和质量的差异,并用免疫组化检测瘤体组织中E7蛋白的表达变化。结果:表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7 mRNA和蛋白的表达。其中载体P1抑制作用最强,在抗性克隆形成后1周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92．86%、84．21%;在抗性克隆形成后4周,抑制率仍分别为68．95%、62．50%。在接种后4周载体P1组裸鼠体内皮下移植瘤的体积和重量明显小于空载体组和对照组,同时E7蛋白的表达也被有效抑制,抑制率为74．75%。结论:构建有shRNA的E7 siRNA表达载体在体内外可明显抑制E7基因的表达。