Cav2.2e37a基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建针对Cav2.2e37a基因的RNAi慢病毒载体,为抑制Cav2.2e37a基因表达治疗神经痛的实验研究打下基础。方法针对已经筛选确定的Cav2.2e37a基因RNAi有效靶序列,构建pLL3.7-Cav2.2e37a干扰质粒,测序鉴定。pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G,pLL3.7-Cav2.2e37a共转染293T细胞,Real-time PCR测定病毒转导滴度。结果成功构建Cav2.2e37a shRNA的慢病毒载体LVshCav2.2e37a。浓缩病毒悬液的滴度为1×109Tu/ml。结论成功构建了Cav2.2e37a基因的RNAi慢病毒载体。

疼痛相关融合基因的构建及siRNA对其抑制作用的研究

目的:通过构建用于RNAi筛选的模拟靶基因,筛选出起作用的siRNA,为进一步研究以Cav2.2e[37a]为靶标的基因治疗提供依据。方法:构建了EGFP-e37a/e37b融合基因,将其放入载体质粒中进行表达。按照siRNA的设计原则设计了四对siRNA(编码为I号、Ⅱ号、Ⅲ号、IV号),并将其放入质粒表达载体中,用siRNA表达载体与融合基因表达载体共转染BHK细胞进行了RNAi试验。用荧光显微镜、流式细胞仪等方法检测RNAi效果。结果:EGFP-e37a/e37b融合基因通过PCR、测序等方法鉴定为正确;在荧光显微镜下可见siRNAⅡ使细胞的荧光效率明显受到抑制,流式细胞术可见siRNAⅡ的RNAi效率在24h达到了90%左右,其余3条siRNA抑制作用不明显。结论:本研究将目的基因e37a与EGFP基因进行了融合构建,通过EGFP的绿色荧光效应显示目的靶基因在细胞内的表达,并观察到RNAi抑制效果,筛选出了有功能的siRNA。