抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。

抗菌肽Cecropin D基因在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析

为使抗菌肽Cecropin D在巴斯德毕赤酵母中高效表达,本研究根据Cecropin D全基因序列和毕赤酵母的偏嗜性设计合成4条寡聚西核苷酸,SOEing-PCR技术法合成Cecropin D基因序列,并克隆至酵母表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒,将其线性化后电击转化毕赤酵母菌株SMD1168,经高浓度博莱霉素筛选,获得高拷贝转化子,菌液PCR鉴定表明Cecropin D基因已整合到酵母基因组中。在GAP强启动子调控下,重组Cecropin D高效分泌表达,产物耐高温耐酸碱,并对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果,对E.coliDH5α和S.aureus Cowan I株的MIC值分别为2.17μg/mL和4.55μg/mL。

家蚕抗菌蛋白Cecropin D和Lysozyme的分离纯化及性质鉴定

经大肠杆菌E．coli K12D31诱导后的家蚕幼虫，其免疫血淋巴经CM-Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析及HPLC分离后，得到2种抗菌蛋白，经液相色谱-电喷雾质谱（ESI-MS）分析鉴定，纯化的2种抗菌蛋白分别是家蚕抗菌肽eeeropin D和溶菌酶lysozyme酸性电泳（A-PAGE）测活免疫血淋巴得到抗菌蛋白活性谱：cecropin D在8h无显著表达，12h有较强抗菌活性，30h达到最高，以后逐渐降低；lysozyme在8h后检测到表达，12h到达高峰，之后逐渐下降，48h的血淋巴中未检测到明显的表达．研究认为抗菌蛋白lysozyme和cecropin D是家蚕幼虫感染细菌8h后大量表达的抗菌蛋白，主要参与细菌感染12～30h的血淋巴对细菌的清除，是参与家蚕幼虫抗菌免疫的重要蛋白．

家蚕抗菌肽基因Cecropin-D的克隆及其真核表达载体的构建

从家蚕中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了家蚕Cecropin-D基因编码区的cDNA,扩增出家蚕抗茵肽Cecropin-D成熟肽基因片段,重组克隆入pMD18-Tvector载体,经DNA测序,该基因为186bp,编码62个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建真核表达栽体pPlC9K-CD。本实验的研究为获得超量表达的高活性表达抗菌肽Cecropin-D以及为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定了基础。

农杆菌法将抗菌肽D基因导入蕉柑胚性细胞的研究

用农杆菌介导的方法成功地将抗菌肽D基因导入到蕉柑胚性悬浮细胞 .再生芽经PCR、Southern杂交证明抗菌肽D基因已整合到其基因组DNA中 .在农杆菌介导的蕉柑胚性悬浮细胞转化过程中 ,共培养介质中的乙酰丁香酮 (As)能显著提高其转化效率 ,与对照相比 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数从 0提高到 0 .75 .悬浮细胞与农杆菌共培养时间对转化效率也具有显著影响 ,共培养 1、2、3d后 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数分别为 0 .2 0、0 75、0 .

转抗菌肽D烟草对土壤微生物群落的影响

采用RAPD分子标记技术研究了种植转抗菌肽D烟草的土壤环境中微生物群落遗传多样性的变化,同时用传统平板培养法研究了土壤中可培养微生物在数量上的变化。RAPD分析结果表明,转抗菌肽D烟草与非转基因烟草根围微生物的遗传多样性相关指数并没有显著差异。培养计数结果表明,转抗菌肽D烟草与非转基因烟草根围可培养细菌在数量上有极显著差异,可培养真菌数量有显著减少,可培养放线菌的数量没有显著差异。说明转抗菌肽D烟草可能抑制了病原细菌及其根围相关的微生物,但是不影响微生物的遗传多样性。

柞蚕杀菌肽D对人直肠癌细胞的杀伤作用及机制

柞蚕杀菌肽D在0．05～200μg／mL浓度范围内对直肠癌细胞的生长有明显抑制作用；用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）对癌细胞的掺入试验，发现能抑制细胞DNA的合成．导致3H-TdR掺入率明显下降。钙离子螯合剂Indo-1-AM能与癌细胞内钙离子螯合而产生特异性荧光，通过粘附细胞激光定量分析及筛选议的观察，发现杀菌肽能破坏细胞的钙离子通道，钙离子迅速逸出细胞外。采用电子显微镜观察直肠癌细胞超微结构的变化，发现杀菌肽首光破坏细胞膜致微绒毛收缩、融合，继而导致细胞器的破坏，最终细胞崩解死亡。正常猴肾细胞CV1，在1.00μg／mL浓度杀菌肽D作用48h，尚未发现不良影响。

几丁质酶和抗菌肽D双价基因转化茄子的研究

在建立茄子的组织培养及遗传转化体系的基础上，以根癌农杆菌为介导，采用叶盘法将几丁质酶和抗菌肽Ｄ双价基因转入茄子，分别获得６株ＫａｎＲ植株。对ＫａｎＲ植株进行点杂交、ＰＣＲ扩增等分子检测。结果表明，目的基因已整合进茄子核基因组中。

转柞蚕抗菌肽D基因辣椒的目的基因及表达产物检测

应用现代生物技术,从核酸和蛋白质水平对转柞蚕抗菌肽D基因辣椒第4代的目的基因进行了检测。发现所分离的柞蚕抗菌肽D基因与原设计的序列一样;辣椒组织中也含有抑菌物质,经与天然抗菌肽D对比,表明抗菌肽D基因得到了表达。

柞蚕抗菌肽D基因转化广藿香的研究

结果表明，柞蚕抗菌肽Ｄ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ－Ｄ）对广藿香青枯病的病原细菌ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＳｏｌａｎａｃｅｒｕｍ有很强的抑制作用。通过农杆菌介导的方法将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ－Ｄ基因导入广蕾香细胞，获得５株转基因植株，并繁殖成无性系。５个无性系在与病原菌共培养时都表现出一定的抗性。

人工设计天蚕素抗菌肽AMP-D及其活性测定

本试验通过对抗菌肽结构改造优化,得到了一条新设计的抗菌肽AMP-D,并利用固相合成技术人工合成后对其活性和溶血性进行测定。试验结果表明,AMP-D对革兰氏阴性菌及真菌没有生物活性,对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用,且其没有溶血活性;AMP-D对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为10.5μg/mL,较原设计肽活性有较大提高。

人工会成柞蚕杀菌肽D基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以质粒pWR450为载体,克隆了人工合成的柞蚕杀菌肽D基因(122bp),构建的重组子pWR450-Cec转化大肠杆菌JM103、用限制性内切酶酶切鉴定。产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示可表达杀菌肽-β-gal融合蛋白。

柞蚕抗菌肽D中精氨酸、赖氨酸和色氨酸等氨基酸残基的化学修饰

用不同的化学试剂修饰了柞蚕抗菌肽D分子中的色氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸残基。NBS修饰抗菌肽D,以及氨肽酶M对抗菌肽D作用的结果表明色氨酸残基对抗菌肽D抑制E.coli D31的作用影响不大。CHD和MLH对精氨酸和赖氨酸残基的修饰,导致抗菌肽D失去抑制E.coli的作用,但可逆地消除CHD和MLH的修饰作用后,抗菌肽D恢复了对E.coli D31的抑菌作用。这些结果初步认为,抗菌肽D抑菌作用与分子中的荷电性有关,改变了分子的电荷,也就同时失去了其抑菌功能。 此外,对精氨酸残基修饰的结果还表明,抗菌肽D的免疫原性与精氨酸残基有关。但是,抗菌肽D的免疫决定簇与其生物活性中心并不完全平行。

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因及抗菌肽D基因双抗表达载体的构建

选取分别被克隆到Ｃｏ２４质粒和ＢＳ质粒上的番木瓜环斑病毒外壳蛋白（ＰＲＳＶ—ＣＰ）基因和柞蚕抗菌肚Ｄ（ＣｅｃｒｏｐｉｎＤ）基因为材料，构建了单抗表达载体ＦＫ３和ＰＣｏ２５，进一步构建了双抗植物表达载体ｐＫＰＴ。这为开展单抗和多抗植物基因工程的研究提供了重要途径。

柞蚕抗菌肽D基因转化桉树培育抗青枯病株系的研究

通过二次正交旋转组合设计对尾叶桉叶盘愈伤组织分化培养基优化 ,获得尾叶桉 (Eucalyptusuro phylia)叶盘外植体的再生植株。将携带外源目的基因的根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)与尾叶桉U6无性系叶盘共培养 ,经愈伤组织诱导、卡那霉素筛选和植株再生 ,获得 2 0个小芽 ,再将小芽转入附加卡那霉素(Kam) 4 0 μg·mL- 1 的E3-B培养基中诱根 ,获得 8株存活且可再生的转化子。取转化苗叶片作胭脂碱合成酶活性检测电泳后呈阳性 ;分别以γ 32 p dCTP及地高辛标记柞蚕抗菌肽D基因作探针 ,与转化苗DNA作点杂交及Southern印迹杂交检测 ,结果均呈阳性。以上结果表明 ,柞蚕抗菌肽D基因已整合到尾叶桉基因组中。将从桉树青枯病重病区分离的强毒青枯菌 (Pseudomonasspp .)株 (9910 16 )以 1× 10 9cfu·mL- 1 浓度接种转化试管苗 ,以未经转基因的尾叶桉U6 无性系试管苗为对照 ,结果表明转化苗接种死亡率 5 6 7% ,对照死亡率为 86 7% 。

柞蚕杀菌肽D对宫颈癌细胞株生长的抑制作用

用大肠杆菌（Ｋｌ２Ｄ３ｌ）诱导柞蚕，取其血淋巴，分离纯化出杀菌肽Ｄ。研究了不同浓度、不同作用时间的杀菌肽Ｄ对３Ｈ－ＴｄＲ参入ＳｉＨａ细胞的影响。结果显示：在２４ｈ内具有促进作用，４８ｈ后参入受抑制。由此可见杀菌肽Ｄ对肿瘤细胞ＤＮＡ合成具有一种调控抑制作用，而非一般抗肿瘤药物的单纯抑制作用。

转抗菌肽基因辣椒蛋白质检测技术研究

以转抗菌肽BD基因辣椒为材料 ,研究建立转基因食品中外源目的蛋白的检测技术 ,并建立对其忠实表达状况和安全性进行评价的模式。以柞蚕蛹免疫血淋巴作为标准 ,对照检测转抗菌肽辣椒目的蛋白表达的忠实性 ,采用针对转基因食品技术特点而预先设计的技术路线进行分析检测。研究和检测步骤为 :目的蛋白经粗提 ,达到初步纯化。再用两次CM Sepharose FF离子交换柱层析进行中度纯化。纯化产物通过测定抗菌活性、电泳及生物自显影、质谱进行鉴定。系统的检测结果表明 ,以抗菌肽目的基因构建的重组体在导入辣椒后 ,所表达的外源目的蛋白与对照标准蛋白的理化性质、抗菌活性、分子量一致 ,说明在该转基因辣椒中抗菌肽目的基因的表达是忠实的 ,与期望值相符。本研究建立了目的蛋白抗菌肽D的分离纯化及鉴定技术 ,建立了转基因辣椒外源目的蛋白的鉴定方法。

双价抗菌肽基因表达载体的构建

将人工合成的抗菌肽Ｄ基因和抗菌肽Ｂ基因克隆到同一植物表达载体ｐＢⅠ１２１，且各自具有其３５ｓ启动子和Ｎｏｓ终止子。先将抗菌肽Ｄ基因及其启动子和终止子克隆到ｐＢ１２１ＨｉｎｄⅢ位点获得ｐＥＣＶⅠ重组子。然后将抗菌肽Ｂ基因克隆到ｐＥＣＶⅠ的ＢａｍＨⅠ位点，经Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ检测和酶切鉴定获得具有抗菌肽Ｄ，抗菌肽Ｂ基因的双价基因表达载体ｐＥＣＶⅡ。

双抗植物表达载体的构建

用限制性内切酶将抗虫的胰蛋白酶抑制剂（ＴＩ）基因从质粒ｐＢｉｎ２０上切下，插入带有抗细菌的抗菌肽Ｂ和抗菌肽Ｄ基因的植物表达载体ｐＤＢ３的ＸｂａⅠ位点。通过点杂交和酶切鉴定，得到了带有３个抗性基因的双抗植物表达载体ｐＤＢＴ．