猪蛔虫抗菌肽Cecropin p基因的克隆及其原核表达载体的构建

从猪蛔虫提取总RNA,反转录成cDNA后分别设计引物对Cecropin 2、Cecropin 3和Cecropin 4基因进行PCR扩增,分别得到带有双酶切位点的目的基因片段.将目的基因片段与PMD18 T载体连接,转化Top10克隆菌,测序正确后克隆入pET28a表达载体,进行双酶切和测序鉴定.研究结果表明,克隆得到的Cecropin p2、Cecropin p3和Cecropin p4基因均由225个碱基组成,一个编码由74个氨基酸残基组成的开放阅读框,其蛋白相对分子质量约为8 kD,等电点分别为9.86、10.16和9.16.同源性分析结果显示:克隆所得猪蛔虫Cecropin p2、Cecropin p3和Cecropin p4与数据库NCBI中的猪蛔虫Cecropin p2、Cecropin p3和Cecropin p4基因同源性均为100%,与其它Cecropin p基因同源性也较高(>42%).分子进化树显示,Cecropinp4的分化出现最早,其次为Cecropin p2,Cecropin p1和Cecropin p3分化得最晚.成功克隆了猪蛔虫Cecropin 2、Cecropin 3和Cecropin 4基因,构建了它们的原核表达载体并进行了生物信息学分析,为其重组表达和抑菌活性鉴定等研究奠定了理论基础.