人真皮微血管内皮细胞缺氧后处理模型的建立

目的探讨建立人真皮微血管内皮细胞的缺氧后处理模型的方法。方法采用酶消化加磁珠分选的方法，获得人真皮微血管内皮细胞，用5％ECM培养基培养，取第6～8代细胞备用，在进行缺氧处理后复氧前，将细胞进行3次一定时间的缺氧／复氧交替处理；将细胞接种于6孔板，1个6孔板为1组，共6组。1组：不作任何处理；2组：缺氧8h＋复氧24h；3组：缺氧8h＋2min×3次缺氧后处理；4组：缺氧8h＋5min×3次缺氧后处理；5组：缺氧8h＋10min×3次缺氧后处理；6组：缺氧8h＋20min×3次缺氧后处理。各组经过8h缺氧箱＋缺氧Buffer的缺氧处理和24h复氧后，检测乳酸脱氢酶（LDH）随缺氧时间含量的变化；Tunel法染色计算各组的细胞凋亡率；用Western Blot的方法检测Bcl-2、Bax和caspase-3以及活化easpase-3的蛋白含量表达。实验数据采用SPSS18．0进行统计分析，2组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。结果在连续的缺氧过程中，LDH含量在8h（1563±83．35）IU／L与0h（582．85±58．25）IU／L比较，差异有统计学意义（P=0．0001）。Western Blot结果：2组Bax／Bcl-2表达含量为0．38±0．02，2组与3组0．23±0．01和4组0．22±0．02比较，差异有统计学意义（P=0．012，P=0．005），2组与5组0．33±0．02和6组0．34±0．01比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。2组活化的caspase-3／easpase-3比例为6．30±1．50，与3组2．17±0．26和4组2．63±0。31比较，差异有统计学意义（P=0．008，P=0．019）；2组与5组4．36±0．29和6组4．97±0．51比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功地建立了人真皮微血管内皮细胞缺氧后处理模型。