蒺藜皂苷对乳腺癌细胞Bcap-37的体外抑制作用

采用生长曲线法、MTT法、蛋白质含量测定以及形态学方法观察了蒺藜皂苷(STT)对于体外培养Bcap-37细胞抑制作用,结果显示:STT对于Bcap-37细胞增殖有较强的抑制作用,且呈明显的剂量与时间依赖关系,经STT作用后,细胞形态学表现为细胞变圆、皱缩,核固缩、浓聚。

维生素E琥珀酸酯联合阿霉素对乳腺癌细胞株Bcap-37的生长抑制作用

目的检测维生素E琥珀酸酯(VES)联合阿霉素(ADM)对乳腺癌细胞生长抑制作用。方法以VES联合ADM作用于人乳腺癌Bcap-37细胞24h和36h,VES浓度为5、10、20mg/L,ADM的浓度分别为0.25、1、2mg/L。采用MTT法测定对细胞增殖的抑制作用,以流式细胞仪分析药物联合作用前后乳腺癌细胞凋亡率的变化和对细胞表面Fas表达的影响。结果VES联合ADM对乳腺癌Bcap-37细胞具有显著的生长抑制和凋亡诱导作用。流式细胞仪分析细胞周期,Bcap-37细胞的自然凋亡率为0.7%,5mg/L和20mg/LVES作用24h后凋亡率分别为10.1%和19.2%,1mg/L和2mg/LADM作用24h后的凋亡率分别为16.0%和23.3%。5mg/LVES联合1mg/LADM以及20mg/LVES联合2mg/LADM作用24h后的凋亡率分别升高至31.1%和40.7%。VES联合ADM作用24h后Bcap-37细胞表面Fas表达增强。结论VES联合ADM对乳腺癌Bcap-37细胞具有显著的生长抑制作用,其机制可能与细胞表面Fas表达上调有关。

Cyclopamine对人乳腺癌细胞Bcap-37生长和增殖的影响

目的：研究Hedgehog信号通路特异性抑制剂Cyclopamine对人乳腺癌细胞Bcap-37生长和增殖的影响。方法：培养Bcap-37细胞系，加入Hedgehog（Hh）信号通路特异性抑制剂Cyelopamine作用72h，观察光镜下细胞形态学的变化；采用单四唑（Mar）和溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入的方法，检测Cyclopamine对Beap-37细胞系生长和DNA合成的影响；再用流式细胞仪检测Cyclopamine对Bcap-37细胞周期的影响。结果：与对照组相比，加入5×10^-6mol／L的Cyclopamine后在倒置显微镜下可见细胞立体感消失，细胞内空泡增多；5×10^-6mol／L的Cyelo-pamine使Bcap-37细胞的生长曲线下移，10^-7-10^-5mol／L的Cyelopamine可剂量依赖性地抑制Bcap-37细胞的生长；Bcap-37细胞系的DNA合成被Cyelopamine明显抑制，S期细胞比例降低，并出现了明显的G2期阻滞。结论：Cyclopamine可以有效地抑制Bcap-37细胞的生长和增殖，提示Hh信号通路可能在乳腺癌中被异常激活，抑制Hh信号通路的活性可能对乳腺癌的治疗起到一定的作用。

端粒酶RNA模板定点突变对肿瘤细胞Bcap-37的作用研究

端粒酶在正常体细胞中极少表达,而在大多数人类恶性肿瘤和细胞系中高度表达,这暗示着端粒酶活性可能与肿瘤密切相关。本研究以人乳腺癌细胞株Bcap-37接种裸鼠形成的肿瘤组织块为实验材料,通过检测端粒酶活性、端粒长度及细胞凋亡的情况,观察端粒酶RNA模板定点突变的作用。结果显示:MT-hTER组样本的端粒酶活性低于对照组,端粒长度短于对照组,细胞核形态不够稳定,有较多细胞凋亡的现象,而对照组细胞核形态稳定,较少发生细胞凋亡。以上结果提示着端粒酶RNA模板定点突变在一定程度上改变了人乳腺癌细胞株Bcap-37的端粒酶活性、端粒长度及细胞凋亡发生率。

人体乳腺癌细胞系BGaP-37和MGF-7的细胞遗传学研究

本文应用普通染色体G一显带技术和高分辨染色体显带技术对两个人体乳癌细胞系进厅了详尽的细胞遗传学研究。结果显示两个细胞系均具有较复,桀的染色体结构和数目_}辛常。Bcap一3 7细胞系染色体众数为62～63,具有23个可识别其结构的标记染色体。MCF一7细胞系染色体众效为55—56,具有l9个可识别其结构的标记染色体,进一步分析认为,第1、3、5、7、11、13和17号染色体的数目和结构改变,可能与乳腺癌的发生和演进有一定联系;染色体断点1p^(11)(1q^(11))、1p^(13)、3p^(21)、3q^(11)、5q^(11)、7p^(13)、7q^(22)及导致11p^-、17p^-6q^-、13q^-的断裂点可能通过癌基因的激活和抗癌基因的丢失而起一定怍用。

沙棘黄酮类化合物对人乳腺癌细胞生长抑制和凋亡诱导的研究

为研究沙棘籽渣黄酮类化合物(FHR)对人乳腺癌细胞Bcap-37的生长抑制和凋亡的诱导作用,探讨其抗癌作用的机制,本项研究应用CCK-8法检测FHR对Bcap-37的生长抑制效应,流式细胞术(FCM)分析细胞周期及凋亡率,透射电镜观察细胞凋亡的超微结构表征,半定量RT-PCR方法和Westernblot方法检测与细胞周期及凋亡调控相关基因的转录和表达的变化。结果表明,FHR可明显抑制Bcap-37的增殖,并呈剂量依赖性;FCM分析发现在FHR1000μg/ml作用24h后能阻断Bcap-37细胞于G2/M期,并伴有少量的亚G1峰出现;TEM观察Bcap-37细胞经FHR作用后具有典型的凋亡形态学特征;半定量RT-PCR结果显示,经1000μg/mlFHR作用24h后,PCNA、Bcl-2转录水平分别下调为对照组的0.26倍和0.66倍,IGFBP4转录水平上调为对照组的1.13倍。Westernblot结果显示p53蛋白表达显著上调,Bcl-2蛋白表达显著下调。本项研究结果提示FHR可能是通过下调PCNA的转录使细胞的增殖被阻断在G2/M期,并通过p53蛋白上调和Bcl-2蛋白的下调诱导Bcap-37细胞凋亡。

重组HIV-TATm-Survivin(T34A)蛋白制备及其促癌细胞凋亡活性研究

从人乳腺癌细胞系B-Cap-37中克隆出Survivin的cDNA,并对其中编码34位Thr的密码子定点突变为Ala的密码子后,经一系列基因操作方法将天然HIV-TAT转导肽的突变体基因HIV-TATm引入Survivin(T34A)基因的5′端,正确构建了表达载体pRSET-B-HIV-TATm-Survivin(T34A),经转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,目的蛋白质以包涵体形式表达,占菌体总蛋白的45%。经3.7L发酵罐分批发酵可收获650mg/L的包涵体,经阳离子交换、凝胶层析分离和柱上复性与透析,得到纯度达96%以上的可溶性目的蛋白HIV-TATm-Survivin(T34A)。目的蛋白对人乳腺癌细胞B-Cap-37、人胰腺癌细胞SW1990和人肝癌细胞SSMC-7721作用4h后有在细胞形态上呈现出显著的凋亡特征,而对人宫颈癌细胞系Hela不敏感,对正常的人内皮细胞系EVC-304未见明显影响。作用24h时MTT法检测显示,120μg/mL目的蛋白对SW1990、B-Cap-37、SSMC-7721和Hela细胞的抑制率分别达到89%、63%、59.5%和39%,且具有剂量依赖性。对最为敏感的SW1990和B-Cap-37以每孔60μg/mL终浓度的目的蛋白作用48h的流式细胞技术检测发现,凋亡率分别为25.6%和19.3%,与对照相比,实验组细胞出现明显的凋亡峰,细胞周期的分布发生明显的变化,65%以上的癌细胞被阻滞于G1期。体外实验结果显示重组目的蛋白具有较强的抑制癌细胞增殖和促进凋亡作用,预示着良好的抗癌前景。

冬凌草甲素对人乳腺癌Bcap-37细胞的增殖抑制作用及其机制

目的观察冬凌草甲素对人乳腺癌细胞株Bcap-37细胞的生长抑制作用,初步探讨冬凌草甲素调控乳腺癌细胞增殖的分子机制。方法 MTT比色法检测冬凌草甲素对Bcap-37细胞的增殖抑制作用,相差显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪分析细胞周期分布,RT-PCR检测p21、cdc2和cyclin B1 mRNA表达。结果冬凌草甲素对Bcap-37细胞有显著的增殖抑制作用,呈时间剂量依赖趋势(P<0.01);处理后的Bcap-37细胞发生明显的形态改变;作用24h后,Bcap-37细胞在G2/M期阻滞;冬凌草甲素作用Bcap-37细胞后,p21 mRNA水平的表达增加,而cdc2、cyclin B1 mRNA的表达降低(均P<0.05)。结论冬凌草甲素可抑制乳腺癌细胞的增殖,该作用可能与p21 mRNA表达上调及cdc2、cyclin B1 mRNA表达下调有关。

抗菌肽LL-37在巨噬细胞促卵巢癌细胞增殖中的作用

目的研究抗菌肽LL-37在巨噬细胞促进卵巢癌细胞增殖中的重要作用。方法采用Transwell插入式细胞培养皿共培养人巨噬细胞和卵巢癌细胞株SKOV3、3AO和HO-8910。采用溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）-酶联免疫吸附试验（ELISA）法和细胞计数法检测巨噬细胞对卵巢癌细胞增殖能力的影响。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot法检测巨噬细胞和SKOV3细胞中LL．37mRNA和蛋白的表达。应用LL-37中和抗体抑制LL-37的功能活性，观察LL-37在巨噬细胞促进卵巢癌细胞增殖中的作用e结果细胞计数法检测结果显示，SKOV3细胞与巨噬细胞以1：0．5的比例共培养4d后，SKOV3细胞的数量从（6．0±0．5）×10^4个增加为（11．8±1．3）×10^4个，差异有统计学意义（P〈0．05），并且随着共培养的巨噬细胞比例的增加，SKOV3细胞的数量也随之升高（P〈0．05）。与巨噬细胞共培养后，3AO和HO-8910细胞的数量变化趋势与SKOV3细胞相似。BrdU—ELISA法检测的结果与细胞计数法一致。RT-PCR和Westem blot法检测结果显示，在与卵巢癌SKOV3细胞共培养后，巨噬细胞中LL-37 mRNA和蛋白的表达均上调，且随着时间的延长其表达增加，但其在SKOV3细胞中的表达并未增强。BrdU—ELISA法检测的结果显示，经LL-37处理后，HO-8910和3AO细胞的增殖能力明显增加；但加入LL-37中和抗体后，可明显抑制巨噬细胞对SKOV3、3AO和HO-8910细胞的增殖促进作用，这3株细胞的吸光度分别从2．95±0．11降至1．45±0．04，3．39±0．36降至1．32±0．09，3．93±0．17降至1．68±0．23（均P〈0．05）。结论在与卵巢癌细胞相互作用的条件下，巨噬细胞通过增强抗菌肽LL-37的表达和分泌促进了卵巢癌细胞的增殖。LL-37在巨噬细胞促进卵巢癌的发展中扮演重要角色。

LL-37慢病毒过表达载体和RAW264.7-LL-37稳转细胞株的构建

目的构建LL-37慢病毒过表达载体,稳定转染RAW264.7细胞株,并检测LL-37在胞内mRNA和蛋白表达情况。方法根据GenBank数据库获取抗菌肽LL-37的蛋白编码基因序列,同时选择合适的酶切位点并设计特异性的上、下游引物,PCR扩增目的基因。用SalI、Age I限制性内切酶对载体和目的基因进行双酶切,将酶切目的片段与载体进行重组。重组质粒冰水浴30 min、42℃热激1.5 min、冰上放置2 min后转化入DH5α感受态细胞。将感受态细胞在不含氨苄的LB培养基中,37℃、200 r/min培养1 h。将转化菌在含氨苄平板上进行筛选,阳性菌落进行PCR和测序鉴定,鉴定正确的菌落进行扩增并大量抽提质粒。将20μg GV载体质粒、15μg pHelper 1.0载体质粒、10μg pHelper 2.0载体质粒与转染试剂混合后共转染293T细胞,收集细胞上清液,经离心、过滤后保存。将包装浓缩后的慢病毒按照MOI=100稳转RAW264.7细胞株,并用嘌呤霉素筛选LL-37慢病毒过表达RAW264.7细胞株。分别采用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测转染成功的RAW264.7细胞中mRNA和蛋白表达情况。结果成功获得7487 bp的线性化载体和164 bp的LL-37PCR片段,成功构建LL-37慢病毒过表达载体。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞中,经PCR和测序鉴定重组质粒构建正确。经包装浓缩后的慢病毒成功稳转RAW264.7细胞株,并用嘌呤霉素筛选出LL-37慢病毒过表达RAW264.7细胞株。RT-PCR检测携带重组质粒的慢病毒转染的RAW264.7细胞,胞内mRNA有良好表达丰度,LL-37基因的表达丰度为9074.883(P<0.01)。加入LL-37抗体的细胞株组在CQ1荧光拍照下能够观察到荧光,空白组和阴性对照组无此荧光,表明稳转LL-37 RAW264.7细胞株构建成功。结论成功构建LL-37慢病毒过表达载体并获得在胞膜及包浆均有大量表达LL-37的慢病毒稳转RAW264.7细胞株,为LL-37相关作用机制研究奠定了基础。