姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞中核因子-κB相关炎性因子表达的抑制作用

背景白细胞介素-1β（IL-1β）是增生性玻璃体视网膜病变（PVR）早期释放的重要炎性因子，研究证实姜黄素能抑制IL-1β诱导的兔视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生，但其是否能够对PVR发挥抗炎作用尚不清楚。目的观察姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞移行的影响，探讨姜黄素对IL-1β诱导的RPE细胞中炎性因子表达的影响。方法采用对数生长期原代培养的第4代兔RPE细胞进行实验，在无血清DMEM培养基中分别添加0、0．1、1．0和10．0μg／L的IL-1β作用于细胞24h，分别采用Western blot和逆转录PCR法检测细胞中环氧合酶-2（COX-2）蛋白和mRNA的表达以筛选IL-1β最佳质量浓度。将培养的RPE细胞分为IL-1β组和姜黄素＋IL-1β组，分别在无血清培养基中添加1．0μg／L IL-1β和1．0μg／L IL-1β联合10μg／ml姜黄素作用于细胞24、48和72h，仅用无血清培养基培养的细胞作为对照组。培养的细胞行苏木精-伊红染色，于光学显微镜下计算进入损伤区的细胞数，比较各组细胞的移行能力；分别采用Western blot法和逆转录PCR法检测各组RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量，采用Westernblot法检测并比较各组细胞中核因子-κB p65（NF—κB p65）蛋白和核因子κB抑制蛋白-α（IκB—α）的相对表达量；采用免疫化学染色法检测NF—κB p65、IκB-α和COX-2在各组RPE细胞中的表达和定位。结果初分离的兔RPE细胞呈球形，细胞中可见大量黑色素颗粒；第4代细胞色素颗粒明显减少，接近融合的细胞形态为长梭形，呈拉网状分布。免疫细胞化学染色法结果显示，细胞角蛋白（AE1／AE3）在细胞质呈阳性表达。对照组在培养24、48和72h移行的细胞数分别为（31．93±1．21）、（36．27±2．50）和（38．33±2．40）个，IL-1β组分别为（45．73±2．30）、（71．13±1．92）和（80．60±1．71）个，而姜黄素＋IL-1β组分别为（13．13±2．20）、（14．93±1．10）和（12．60±1．51）个，各时间点IL-1β组细胞移行细胞数均明显高于对照组，而姜黄素＋IL-1β组移行细胞数均明显低于对照组和IL-1β组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。IL-1β质量浓度为1．0μg/L时，RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量达峰，以1．0μg／L IL-1β的剂量进行后续实验。细胞培养后24、48和72h，姜黄素＋IL-1β组细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量均明显低于IL-1β组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。IL-1β作用于细胞后48h，细胞中NF—κB p65蛋白的相对表达量最高，与IL-1β组相比，各时间点姜黄素＋IL-1β组细胞中NF—κB p65蛋白相对表达量降低，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。IL-1β组药物作用于细胞后48h细胞中IκB—α降至最低，各时间点姜黄素＋IL-1β组细胞中IκB-α值均明显高于IL-1β组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。免疫细胞染色结果显示，IL-1β组RPE细胞的细胞核及细胞质中NF—κB p65呈强阳性表达，对照组表达较弱，姜黄素＋IL-1β组细胞中NF—κB p65的表达强度较IL-1β组明显降低；与对照组相比，IL-1β组细胞的细胞质中IκB-α表达强度明显减弱，而COX-2表达明显增强；与IL-1β组比较，姜黄素＋IL-1β组细胞中IκB-α表达明显增强，而COX-2表达明显减弱。结论姜黄素可抑制IL-1β引起的兔RPE细胞的移行，IL-1β通过激活NF—κB信号通路刺激细胞中COX-2的表达，姜黄素可通过阻断这一途径而抑制炎性因子的表达，从而发挥抗炎作用。

Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔对人LECs增生、迁移及ECM合成的抑制作用

背景 白内障囊外摘出术后晶状体囊残留的晶状体上皮细胞（LECs）的生物学行为改变是后发性白内障的主要病理改变.Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔具有抑制细胞骨架的重构、迁移、黏附及纤维化等作用,但对LECs的作用尚不清楚.目的 探讨盐酸法舒地尔对人LECs株HLEB-3细胞增生、迁移的作用及其对细胞外基质（ECM）合成的影响.方法 常规培养HLEB-3细胞,对照组细胞仍进行常规培养,药物组培养液中加入不同浓度的盐酸法舒地尔,使其终浓度分别为10、20、40和60 μmol/L,分别于培养后12、24和48 h采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组细胞的增生情况,计算不同剂量盐酸法舒地尔对细胞增生的抑制率;分别于处理后12、24、36和48 h采用Transwell小室迁移实验检测各组的迁移细胞数;并于上述时间点采用ELISA法检测各组细胞上清中Ⅰ型胶原（COL-Ⅰ）、纤维连接蛋白（FN）的质量浓度及细胞内α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）质量浓度,对各组间的检测结果进行比较.结果 不同浓度盐酸法舒地尔组HLEB-3细胞增生抑制率均明显高于对照组,随着盐酸法舒地尔浓度的增加,HLEB-3细胞增生抑制率明显增加,组间总体差异有统计学意义（F浓度=966.727,P=0.000）;随着盐酸法舒地尔作用时间的延长,HLEB-3细胞增生抑制率明显增加,总体比较差异有统计学意义（F时间=280.428,P=0.000）.Transwell小室迁移实验显示,实验后48 h,对照组穿过聚碳酸酯膜的细胞数为（29.20±1.28）个,10、20、40和60 μmol/L盐酸法舒地尔组迁移的细胞数分别为（24.40±1.33）、（17.00±1.10）、（14.60±0.68）和（6.60±1.29）个,随着盐酸法舒地尔浓度的增加,HLEB-3细胞的迁移数逐渐减少,差异有统计学意义（F=57.34,P＜0.05）.随着盐酸法舒地尔浓度的增加和作用时间的延长,细胞上清液中COL-Ⅰ和FN质量浓度逐渐降低,差异均有统计学意义（COL-Ⅰ：F浓度=143.992,P=0.000;F时间=113.745,P=0.000.FN：F浓度=81.761,P=0.000;F时间=69.602,P=0.000）;细胞内α-SMA质量浓度逐渐下降,差异均有统计学意义（F浓度=78.156,P=0.000;F时澡 =65.162,P=0.000）.结论 盐酸法舒地尔可抑制体外培养HLEB-3的增生、迁移及ECM的合成,其作用呈剂量和时间依赖性.

二甲双胍对炎症状态下人视网膜血管内皮细胞生物学行为的保护作用及其机制

背景研究表明炎性过程参与糖尿病视网膜病变（DR）的发生和发展，而炎症作用的靶细胞为视网膜血管内皮细胞（RVECs）。二甲双胍是临床上常用的降血糖药物，近年来表明其可发挥保护心血管、预防肿瘤和保护血－脑屏障等多重生物学效应，但其对炎症状态诱导的人视网膜血管系统异常是否具有防护作用尚不清楚。目的观察二甲双胍对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激下人视网膜血管内皮细胞（RVECs）增生、移行以及分泌单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和白细胞介素-8（IL-8）的影响，探讨二甲双胍对炎症环境中人RVECs生物学行为的保护作用。方法对原代RVECs进行培养和传代并分为正常对照组、5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α（2.5 ng/ml）组、TNF-α＋不同浓度（5、10、20、40 mmol/L）二甲双胍组，分别按照分组方法在培养液中添加相应药物处理24 h。分别于处理前及处理后24 h采用Image-Pro Plus Software 7.0软件计数各组细胞数目；采用MTS法检测各组RVECs的吸光度（A490）值以评价细胞的代谢活力；采用Transwell小室法检测各组迁移细胞数；采用ELISA法检测各组细胞上清液中MCP-1和IL-8质量浓度，并对各组间检测结果进行比较。结果正常对照组、5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α组、TNF-α＋5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α＋10 mmol/L二甲双胍组、TNF-α＋20 mmol/L二甲双胍组和TNF-α＋40 mmol/L二甲双胍组细胞数目总体比较差异有统计学意义（F＝189.31，P〈0.01）；各组细胞代谢活力（A490值）分别为0.32±0.02、0.32±0.03、0.97±0.02、0.90±0.05、0.76±0.15、0.74±0.05和0.41±0.03；各组细胞移行数目分别为（1 214±49）、（1 200±45）、（1 648±43）、（1 309±48）、（1 279±73）、（961±60）和（942±106）/视野；各组细胞上清液中MCP-1质量浓度分别为（0.385±0.050）、（0.362±0.060）、（2.285±0.200）、（1.131±0.180）、（0.622±0.120）、（0.537±0.090）和（0.492±0.130）μg/ml，IL-8质量浓度分别为（0.385±0.080）、（0.390±0.120）、（1.123±0.130）、（0.899±0.180）、（0.680±0.060）、（0.417±0.090）和（0.335±0.100）μg/ml，组间A490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度的总体比较差异均有统计学意义差异（F＝73.31、103.89、150.92、268.32，均P〈0.01），TNF-α组细胞数目、A490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度均明显高于正常对照组，TNF-α＋10 mmol/L二甲双胍组、TNF-α＋20 mmol/L二甲双胍组、TNF-α＋40 mmol/L二甲双胍组细胞数目、A490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度均明显低于TNF-α组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论二甲双胍对TNF-α诱导的人RVECs增生、移行及分泌MCP-1、IL-8的能力均有抑制作用，从而可能对炎症环境中的RVECs发挥保护作用。

MMPs抑制剂GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ及Ⅱ对人晶状体上皮细胞移行的抑制作用

背景 白内障术后残留晶状体上皮细胞（LECs）的增生、移行、上皮-间质转化等生物学行为与晶状体后囊膜混浊（PCO）的发生有关,基质金属蛋白酶（MMPs）参与细胞的移行过程.广谱MMPs抑制剂GM6001能抑制人LECs的移行,但特异性MMPs抑制剂,即MMP-2/9抑制剂Ⅰ和Ⅱ对LECs移行能力的影响及药物的安全性尚不明确. 目的 比较GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ对LECs移行的抑制作用及其对细胞活性的影响.方法 对人LECs系进行培养和传代,取传至3～4代的细胞培养于6孔板中,当细胞生长融合至70％后改用无血清培养液作用12h,在培养液中分别加入不同浓度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00、64.00、128.00μmol/L）GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ,以基础培养液培养的细胞作为对照组,用200μl无菌枪头在细胞层中划出细胞裸露区,继续培养后24 h计算各组细胞移行的平均距离,计算各种药物对LECs移行的抑制率.在细胞活性的测定中,取传至第2代或第3代LECs,调整细胞密度至5＆#215;105/ml,以200 μl/孔接种至96孔板常规培养,分别加入128.00 μmol/LGM6001、64.00μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅰ和32.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅱ,以基础培养液培养的细胞作为对照组,培养24 h后用MTT法测定吸光度（A）值,分析并比较3种药物对LECs活性的影响,评估药物对细胞的毒性作用.结果 正常培养的LECs生长良好,贴壁生长的细胞呈梭形或多边形,排列不规则.随着GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ浓度的增加,LECs移行距离逐渐缩短,总体比较差异有统计学意义（GM6001：F=248.647,P＜0.05;MMP-2/9抑制剂Ⅰ：F=357.125,P＜0.05;MMP-2/9抑制剂Ⅱ：F=396.374,P＜0.05）.将对照组细胞移行距离设为1,3种药物浓度为32.00 μmol/L时,GM6001组、MMP-2/9抑制剂Ⅰ组和MMP-2/9抑制剂Ⅱ组细胞的相对移行距离分别为0.478±0.091、0.294±0.088和0.191±0.081,总体比较差异有统计学意义（F=116.031,P＜0.01）,其中MMP-2/9抑制剂Ⅱ组中细胞移行距离明显低于GM6001组和MMP-2/9抑制剂Ⅰ组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）.对照组、128.00 μmol/L GM6001组、64.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅰ组和32.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅱ组的A值分别为0.607±0.016、0.567±0.015、0.583±0.010和0.595±0.014,总体比较差异无统计学意义（F=1.403,P＞0.05）. 结论 3种MMPs抑制剂均可有效抑制体外培养的LECs的移行,且对细胞的生长活性无明显影响,其中MMP-2/9抑制剂Ⅱ的抑制作用最强。

苯丙氨酸解氨酶诱导人白血病HL-60细胞凋亡的初步研究

目的 :研究苯丙氨酸解氨酶(L phenylalanineammonia lyase ,PAL)对白血病HL 60细胞生长的抑制作用 ,探讨其作用机制。方法 :应用MTT比色法观察PAL对HL 60细胞的生长抑制作用 ,应用倒置显微镜和DNA琼脂糖凝胶电泳技术分析细胞凋亡。结果 :PAL与HL 60细胞共育时 ,能明显抑制细胞生长 ,半数抑制浓度 (IC50 )为 3 0 2U/mL ;细胞呈典型的凋亡形态学改变 ,细胞皱缩 ,染色质凝集 ,沿核膜内侧分布 ,可见新月形 ;细胞DNA裂解成 180～ 2 0 0bp及其倍数的片段 ,电泳得到特有的梯形条带 ,凋亡率与PAL剂量和作用时间呈依赖关系。结论 :PAL能抑制HL 60细胞的生长 ,诱导细胞凋亡是其抗肿瘤的作用机制之一。

柴胡舒肝散含药血清对乳腺癌MCF-7细胞的体外抑制作用及Bcl-2与VEGF的影响

目的探讨柴胡舒肝散含药血清对人乳腺癌MCF-7细胞株体外抑制作用及Bcl-2与VEGF的影响。方法选取SD雌性大鼠48只,随机分为空白对照组、他莫昔芬组和柴胡疏肝散高、低剂量组。利用他莫昔芬片和不同浓度的柴胡疏肝散进行干预,留取含药血清检测MCF-7细胞凋亡,Bcl-2的蛋白表达及血清中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。结果柴胡疏肝散组、他莫昔芬组均可以诱导MCF-7细胞的凋亡,其中柴胡舒肝散高剂量组诱导MCF-7细胞凋亡率高于低剂量组和他莫昔芬组,差异有统计学意义(P<0.05);Bcl-2蛋白在干预组中的表达明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);柴胡疏肝散高、低剂量组及他莫昔芬组、空白对照组中含药血清上清液中VEGF含量两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论柴胡疏肝散含药血清可以通过抑制Bcl-2蛋白和VEGF因子的水平来诱导MCF-7细胞的凋亡。

血小板反应蛋白1活性片段VR-10合成多肽对恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞增生及迁移的影响

目的 观察血小板反应蛋白1（TSP-1）活性片段VR-10合成多肽对恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞（RF/6A）增生、迁移的影响.方法 培养RF/6A细胞并将其分为对照组,0.1、1.0、10.0 μg/mlVR-10合成多肽组及1.0 μg/ml TSP-1全肽组.细胞培养后6、12、24、48 h,采用噻唑蓝（MTT）法检测各组RF/6A细胞存活率.细胞培养后24 h,Transwell小室实验检测各组RF/6A细胞迁移抑制率.采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测10.0 μg/mlVR-10合成多肽对细胞中半胱天冬酶（caspase）-3、凋亡相关因子（FAS）蛋白表达的影响.采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测10.0 μg/ml VR-10合成多肽对RF/6A细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）、FAS配体（FASL） mRNA表达的影响.结果 MTT法检测结果显示,随作用时间延长,干预组RF/6A细胞存活率越低;随VR-10合成多肽浓度增加,RF/6A细胞存活率也越低.以作用48 h时10.0 μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞存活率最低,为78％.细胞培养24 h后,10.0 μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞迁移抑制率最高,1.0 μg/ml TSP-1全肽组次之.与对照组比较,不同浓度VR-10合成多肽组及1.0 μg/ml TSP-1全肽组RF/6A细胞迁移抑制率均明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）.Western blot检测结果显示,在相对分子质量32＆#215;103、20＆#215;103处可见caspase-3蛋白条带,在相对分子质量48＆#215;103处可见FAS蛋白条带.10.0 μg/ml VR-10合成多肽组与对照组RF/6A细胞中caspase-3（t=-66.240、138.813）、FAS（t=163.114）蛋白表达比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）.RT-PCR检测结果显示,与对照组比较,10.0 μg/ml VR-10合成多肽组bcl-2 mRNA表达明显降低,差异有统计学意义（t=-67.419,P=0.000）;FASL mRNA表达明显增强,差异也有统计学意义（t=39.365,P=0.001）.结论 TSP-1活性片段VR-10合成多肽能抑制RF/6A细胞增生、迁移.

腺病毒介导Tum5重组基因对高糖刺激下恒河猴视网膜血管内皮细胞增生、迁移及管腔形成的影响

目的观察腺病毒介导Turn5重组基因对高糖刺激下恒河猴视网膜血管内皮细胞（RF／6A细胞）增生、迁移及管腔形成的影响。方法构建空载体病毒rAd-绿色荧光蛋白（GFP）和携带Tum5基因的重组腺病毒表达载体（rAd—Tum5）。分别感染RF／6A细胞，流式细胞仪检测感染效率。细胞感染48h后，采用蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测Tum5重组基因体外表达。将RF／6A细胞分为正常对照组、高糖刺激对照组（HG组），空载体对照组（HG＋rAd—GFP组），Tum5基因组（HG＋rAd—Tum5组）。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）、侵袭小室（Transwell）实验及基质胶（Matrigel）实验分析Tum5重组基因对高糖刺激下RF／6A细胞增生、迁移及管腔形成的影响。结果流式细胞仪检测结果显示，tAd—GFP、rA＆Tum5感染细胞的效率分别为55．13％、50．31％。Westernblot检测结果显示，HG＋rA＆Tum5组在相对分子质量14×10^3左右处可见Tum5蛋白表达条带；正常对照组、HG组、HG＋rAd—GFP组均未见Tum5蛋白表达条带。CCK-8、Transwell实验及Matrigel实验结果显示，正常组、HG组、HG＋rAd-GFP组、HG＋rAd-Tum5组4组间细胞增生数量、迁移数量及成形管腔数量比较，差异均有统计学意义（F-44．484、772．666、137．696，P（0．05）。组间细胞增生数量、迁移数量及成形管腔数量两两比较结果显示，HG组较正常对照组增加，差异有统计学意义（P〈0．05）；HG组与HG＋rAd—Tum5组之间无明显差异（P〉0．05）；HG＋rAd—Tum5组较HG组、HG＋rAd—GFP组明显减少，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论腺病毒介导Tum5重组基因可抑制高糖刺激下RF／6A细胞的增生、迁移及管腔形成。