重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α的构建及其与ND、IB二联活疫苗联用对鸡免疫功能的影响

为研究重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α与鸡新城疫(Newcastle disease,ND)、传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)二联活疫苗联用最佳肌肉注射剂量及其对鸡免疫功能的影响。通过RT-PCR扩增鸡干扰素-α(IFN-α)基因,双酶切IFN-α基因和pcDNA3.1(+),T4 DNA ligase连接,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α;挑选180只海兰褐公雏鸡随机分为6组,每组3个重复,每个重复10只。A组(生理盐水对照组)、B组(疫苗对照组)、C组[疫苗+100μg pcDNA3.1(+)对照组]、D组[疫苗+50μg pcDNA3.1(+)-ChIFN-α试验组]、E组[疫苗+100μg pcDNA3.1(+)-ChIFN-α试验组]、F组[疫苗+200μg pcDNA3.1(+)-ChIFN-α试验组];4日龄时,D、E、F组分别注射pcDNA3.1(+)-ChIFN-α50、100、200μg/只,C组注射pcDNA3.1(+)100μg/只,A、B组注射生理盐水300μL/只,7日龄时除A组外,其他各组均滴鼻、点眼免疫鸡ND、IB二联活疫苗,于49日龄时,对试验鸡进行肾型IB病毒(Nephropathogenic IB virus,NIBV)攻毒试验。PCR结果表明扩增出鸡IFN-α基因为582 bp,通过测序并与NCBI已发表的ChIFN-α基因(登录号EU367971)进行比对,同源性为100%;双酶切、菌液PCR及测序鉴定结果表明重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α构建成功;动物试验结果表明,不同剂量pcDNA3.1(+)-ChIFN-α均能提高鸡外周血阳性T、B淋巴细胞百分率;提高ND病毒(ND virus,NDV)、NIBV疫苗诱导的抗体水平,并能提高鸡对NIBV强毒株的免疫保护率,且100μg剂量组比疫苗对照组的免疫保护率提高10%。本研究确定重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α最佳注射剂量为100μg/只鸡,其不仅能发挥免疫佐剂作用,还可增强鸡ND、IB二联活疫苗免疫保护效果。

混饮低剂量ChIFN-α对肉鸡细胞免疫功能及细胞因子水平的影响

本实验研究低剂量鸡α-干扰素(ChIFN-α)对肉鸡细胞免疫及细胞因子水平的影响。15日龄肉鸡连续混饮0.1IU/mL、1IU/mL和10IU/mL剂量的ChIFN-α,分别在混饮后14d和21d翼静脉采取血样,采用中性红-结晶紫联合测定白细胞总数,经典方法进行白细胞分类计数,MTT比色分析法测定淋巴细胞转化能力,LDH释放法测定NK细胞的杀伤活性,双夹心ELISA法测定血清中IFN-γ、IL-4、IL-12水平。结果显示肉鸡连续混饮ChIFN-α后,能显著提高白细胞总数、淋巴细胞百分比和血清中IFN-γ水平,对IL-4、IL-12的浓度水平影响不显著,但提高IFN-γ/IL-4的比例,对淋巴细胞增殖和NK细胞的杀伤活性影响不明显。试验表明,混饮低剂量ChIFN-α后可调节肉鸡的细胞免疫功能及细胞因子水平,增强肉鸡的抗病能力。

ChIFN-α酿酒酵母工程菌的发酵条件优化

在PCR检测重组菌株的遗传稳定性基础上,通过单因素试验和多因素正交试验,对酿酒酵母工程菌的实验室摇瓶发酵条件进行优化,得到重组工程菌株的最佳发酵条件为:发酵温度30℃,培养基pH值为5,15%的接种量,以3%的半乳糖作为诱导剂诱导,棉籽糖和葡萄糖作为碳源的发酵时间分别为24h和40h。

混饮低剂量ChIFN-α对健康肉鸡免疫功能及生产性能的影响

试验选取50只雏肉鸡饲养至14日龄,随机分为5组,每组10只,14~42日龄期间试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组每日分别混饮0.1、1.0、10 U/mL剂量ChIFN-α（鸡干扰素-α）,Ⅰ组设为空白组,混饮自来水。Ⅴ组设为阳性对照,混饮50 mg/L盐酸左旋咪唑,研究混饮ChIFN-α后对肉鸡免疫功能及生产性能的影响。结果显示,混饮ChIFN-α后可提高肉鸡外周血白细胞总数、淋巴细胞百分比和嗜碱性粒细胞百分比,降低嗜中性粒细胞百分比和单核细胞百分比;提高肉鸡脾脏指数及血清总蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、血清球蛋白（GLO）的浓度及ALB/GLO比值;不影响肉鸡的生长发育。因此,混饮低剂量的ChIFN-α可提高肉鸡的免疫功能,对健康肉鸡的生长无显著的影响。

鸡γ-干扰素与补体受体2蛋白相互作用的研究

【目的】研究鸡γ-干扰素(chicken interferonγ,chIFN-γ)与鸡补体受体2(chicken complement receptor 2,chCR2)蛋白的相互作用,为研究chIFN-γ和chCR2新功能奠定基础。【方法】通过同源重组方法构建chIFN-γ相关表达质粒,利用免疫共沉淀、激光共聚焦和表面等离子共振技术鉴定chIFN-γ与chCR2蛋白的相互作用,并通过分子对接技术模拟chIFN-γ与chCR2蛋白的相互作用模式。【结果】成功构建了pCMV-Myc-chIFN-γ表达质粒。将pCMV-Myc-chIFN-γ和pCMV-HA-chCR2-ΔTM质粒共转染HEK-293FT细胞,结果表明chIFN-γ蛋白可以与chCR2蛋白进行相互作用;将pCMV-Myc-chIFN-γ和pCMV-HA-chCR2-ΔTM质粒共转染DF-1细胞,结果表明chIFN-γ蛋白与chCR2蛋白可以在DF-1细胞中进行共定位。表面等离子共振试验结果显示chIFN-γ与chCR2蛋白之间的平衡解离常数(KD)值为0.362μmol/L,二者之间有较高的亲和力。分子对接试验结果显示,chIFN-γ与chCR2蛋白之间的相互作用模式为Asp23-His150间形成1组盐桥作用,Asn37-Ser143、Glu57-Gly179和Ile93-Tyr184间形成3组氢键作用。【结论】本研究结果证明了chIFN-γ与chCR2蛋白可以进行相互作用,且二者之间的作用模式为1组盐桥和3组氢键作用。

植物体瞬时表达ChIFN-γ蛋白研究

以生菜、洋葱、萝卜为试材,用转入植物表达载体pSH-NGN的根癌农杆菌EHA105分别采用真空渗透法和直接注射法瞬时表达ChIFN-γ蛋白,研究其最佳宿主植物和最佳方法。结果显示,真空渗透法和直接注射法在瞬时表达效率上差异不大,真空渗透操作上更简便、更易掌握;新鲜市售生菜,真空抽气25 min,共培养3 d,瞬时表达效率达到3 645 pg/g,ChIFN-γ蛋白得到高效表达。

转ChIFN-γ烟草对雏鸡的增重及免疫保护作用研究

[目的]为转ChIFN-γ烟草通过口服喂养途径进行免疫应用提供试验依据。[方法]将转ChIFN-γ基因烟草叶片添加到饲料中饲养雏鸡,接种新城疫病毒(NDV)后观察ChIFN-γ疫苗佐剂通过口服喂养方式对雏鸡的增重效果和免疫保护作用。[结果]口服转ChIFN-γ烟草对雏鸡的体重增长有一定促进作用;喂养含转ChIFN-γ烟草叶片饲料1～10d的雏鸡对NDV均表现出不同程度的抗性,其中喂食3d3600UChIFN-γ的效果最好。[结论]该研究表明通过口服转ChIFN-γ烟草叶片来防治鸡新城疫病是可行的。

低温胁迫对转ChIFN-α基因百脉根抗寒生理生化的影响

为研究转Ch IFN-α基因百脉根的低温生长特性,对其进行4℃低温离体水培和可溶性蛋白(SP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和脯氨酸(Pro)的测定分析,探讨低温胁迫对转Ch IFN-α基因百脉根的影响及机制。研究发现,25 d低温处理期间,百脉根植株均生长迟缓,野生型(WT)还出现叶片枯黄和茎基部腐烂等冻害现象。转基因百脉根(TP)植株同期的MDA含量比WT低1.03倍(p<0.01),WT的MDA下降幅度仅为TP植株的86%。TP同期的SP、SOD、Pro含量均较WT高(p<0.01),且出现的降幅小。TP同期的SP、SOD和Pro含量分别是WT的1.21倍、1.27倍和1.72倍(p<0.01),WT同期的SP和SOD降幅分别是TP的2.26倍和1.93倍(p<0.01),TP植株的SOD含量峰值比WT提前5 d,TP的Pro在中后期增至WT植株的150%和129%。结果表明,转基因百脉根具有较好的低温耐受性和耐受生理基础,这对其在高寒山区的进一步应用及管理提供了基础依据。

T1代转ChIFN-γ基因烟草鉴定及其生长表现

鸡γ干扰素(ChIFN-γ)是一类具有抗病毒和免疫保护等广泛生物学活性的禽病防治有效药物,通过植物生物反应器表达生产是降低其生产成本和扩大临床应用范围的重要途径。为获得可以利用的ChIFN-γ转基因烟草生物反应器,本文在对T1代转ChIFN-γ基因烟草(TP)进行遗传稳定性检测的基础上,对其株高、叶片、根系及活力等指标进行测定,探讨外源基因表达对受体植物生长发育的影响。结果表明,TP烟草幼苗在移栽后植株较高,生长较快,叶片较多。株高增长以第7d时最为明显,3个株系的相对生长速度分别为野生型(WT)的253.23%、280.12%和260.42%;TP-1、TP-2和TP-3株系叶片数相对生长速度分别在第28d、28d和14d时达到最大,为WT的117.33%、118.84%和143.79%;在15d时TP株系组培苗的生根数和根系长分别为WT的9.09倍、7.06倍、5.06倍和2.23倍、2.66倍、2.41倍;水培条件下TP株系具有较高的根系活力,以第10d时最明显,分别为WT的1.12、1.44、1.39倍。因此,转ChIFN-γ基因烟草具有一定的生长优势,未表现出生长抑制现象,研究结果为ChIFN-γ转基因植物生物反应器的进一步应用研究提供了依据。

鸡α干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究

通过PCR从三黄肉鸡的肝脏基因组中扩增了鸡α干扰素(ChIFN-α)全长基因。序列分析表明ChIFN-α基因全长582bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因(489bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET-28a(+)-IFNα,使IFN-α置于pET-28a的T7启动子下游并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合。经酶切鉴定,DNA测序证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE,Western-blot分析证实表达出22kD左右的融合蛋白,表达的蛋白以不溶性的包涵体形式存在并且具有良好的免疫学活性。提纯的包涵体纯度可达70%以上,用镍亲和层析方法纯化蛋白则可达到95%。经透析复性后的蛋白在鸡胚成纤维细胞上能够抑制H9N2禽流感病毒的复制。鸡胚试验中重组干扰素抗病毒效果好在H9N2禽流感病毒攻毒组中,能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2μg;重组干扰素对新城疫病毒复制也有一定的抑制能力,延迟该病毒复制时间为12h至48h;雏鸡试验表明重组干扰素也能较好地抵抗H9N2禽流感病毒对雏鸡的感染。两组试验均表明,亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20倍左右。

重组酵母鸡α干扰素的研制及其抗病毒活性测定

目的:通过酵母真核表达系统获得鸡α干扰素,并鉴定其抗病毒生物活性。方法:以ConA刺激4～10小时后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆出鸡α干扰素成熟蛋白基因,通过EcoRI和XbaI两个酶切位点使该基因插入酵母表达载体(pPICZa-A),并把线性化该重组酵母鸡α干扰素载体,通过电转化使鸡α干扰素基因整和到酵母(X33)基因组上,利用微量病变抑制法测定表达的鸡α干扰素的抗病毒活性。结果:实验结果表明重组酵母鸡α干扰素活性单位为10×48U/ml,具有较好的抗病毒效果。结论:实验研究结果表明重组酵母鸡α干扰素具有较好的抗病毒能力。

抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的研制及初步鉴定

目的:制备抗鸡γ-干扰素单克隆抗体(mAb)。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21(DE3)(pET-ChIFN-γ)表达产物的包涵体作为抗原免疫BALB/c鼠,以纯化的GST-ChIFN-γ作为检测抗原,制备抗鸡γ-干扰素mAb;采用ELISA、Dot-ELISA和Westernblot鉴定mAb的特异性。结果:获得2株可稳定分泌抗鸡γ-干扰素mAb的杂交瘤细胞株1G5、5E3,其Ig亚类均为IgG2a,腹水mAb1G5、5E3的ELISA效价分别为1∶1600000,1∶120000。在Dot-ELISA试验中,这2株mAb均只与表达His-ChIFN-γ及GST-ChIFN-γ的重组大肠杆菌反应,与未表达这2种IFN-γ的其他8种菌株均不发生反应。在蛋白质印迹试验中,2株mAb均能与融合蛋白GST-ChIFN-γ、His-ChIFN-γ发生反应,出现特异性条带。结果表明,mAb1G5、5E3是针对鸡γ-干扰素的特异性mAb。结论:成功地制备抗鸡γ-干扰素的mAb,它们在免疫检测、免疫细胞功能分析和免疫调节研究等方面有应用价值。

重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究

为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID50,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×210 U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。

鸡α干扰素的原核表达及纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。

转ChIFN-γ基因烟草抗虫作用初步研究

对田间烟蚜的自然发生情况观察和抗虫试验的研究显示,转ChIFN-γ基因烟叶具有显著的抗虫效果.为探索转基因烟草的抗虫机理,测定了叶片中烟碱含量并对植株组织进行切片染色.结果表明,烟碱含量与对照无显著差异;转基因烟草叶片增厚,细胞致密,细胞壁增厚可能是导致抗蚜虫、抗斜纹夜蛾的最直接因素之一.

ChIFN-γ基因植物表达载体的构建与瞬时表达

为了使鸡干扰素-γ(ChIFN-γ)基因在油菜中获得高效表达,优化了油菜偏爱的密码子,在ChIFN-γ的5′端添加Kozark序列,3′端增加内质网滞留信号肽SEKDEL.应用同尾酶将人工合成的ChIFN-γ,Napin特异性启动子及信号肽与NOS终止子克隆到质粒pSH中构建成植物表达载体pSH-NGN.经生菜瞬时表达,ELISA检测表明ChIFN-γ蛋白获得有效表达.研究结果为进一步遗传转化油菜奠定了基础,同时也对构建基因的正确表达提供了一种新的快速鉴定方法.

转ChIFN-γ基因烟草抗虫机制研究

为探索转ChIFN-γ基因烟草的抗虫作用机制,对虫体蛋白酶活性变化、烟草挥发性成分以及表皮腺毛密度进行了研究.结果表明,烟青虫进食转基因烟草量较少,导致其体内分泌蛋白酶量少、活力低;转基因烟草T0和T1代,黑松三烯和西柏三烯二醇相对含量较对照高;转基因烟草腺毛密度比对照高49.2%.ChIFN-γ基因激活的多种转录因子可能结合了腺毛发育相关基因的cis调节元件,上调了腺毛发育基因的表达,导致腺毛的数量增加,分泌的萜烯化合物增加从而具有显著的抗虫性.

鸡α干扰素基因遗传转化烟草研究(英文)

利用植物生物反应器生产外源药用蛋白近年来备受关注,本研究通过农杆菌介导法,将人工合成的鸡α干扰素基因(ChIFN-α)转化烟草(Nicotiana tabacum)无菌苗叶盘。对抗性植株进行的GUS活性鉴定,PCR和RT-PCR检测表明,ChIFN-α基因已整合到烟草基因组中并具有转录活性,ELISA检测和细胞病变(CPE)抑制试验表明转基因烟草表达的干扰素蛋白具有抗病毒活性。

基于抗原蛋白Fiber-2及细胞因子佐剂的Ⅰ群4型禽腺病毒亚单位疫苗的开发

为了开发一种抗I群4型禽腺病毒(FAd V-4)的亚单位疫苗,选择I群禽腺病毒血清4型流行毒株衣壳蛋白Fiber-2作为保护性抗原蛋白。利用昆虫细胞-杆状病毒系统生产Fiber-2蛋白,通过Westernblot检测重组蛋白的表达情况,利用双向琼脂扩散法检测重组Fiber-2的免疫原性。为了增强亚单位疫苗的免疫保护效果,添加鸡源白细胞介素2(chIL-2)和鸡源γ-干扰素(ch IFN-γ)作为免疫佐剂,与重组Fiber-2单独或混合使用,制备多种形式的亚单位疫苗,并进行动物攻毒保护试验。重组蛋白的Western-blot鉴定结果显示,63 ku处出现Fiber-2蛋白目的条带;双向琼脂扩散试验结果显示,重组蛋白效价达到1∶128,表现出良好的反应原性。动物攻毒保护试验结果显示,单独使用Fiber-2免疫SPF鸡,在50 μg/只的剂量下,可为SPF鸡提供100%的保护效果,以chIL-2和chIFN-γ为免疫佐剂,与重组Fiber-2联合免疫SPF鸡,可显著增强Fiber-2在低剂量(10 μg/只)下的免疫保护效果,上述结果表明重组Fiber-2联合chIL-2和chIFN-γ细胞因子佐剂所制备的亚单位疫苗在抗I群4型禽腺病毒感染领域具有良好的应用前景。

基因工程表达鸡IFN-λ抗Ⅰ群禽腺病毒感染

Ⅲ型干扰素(IFN)又被称为IFN-λ,具有与Ⅰ,Ⅱ型IFN类似的抗病毒特性,但利用不同的配体-受体系统,主要在一些上皮细胞及免疫细胞上发挥作用。本研究评价了用昆虫杆状病毒表达系统制备的重组鸡IFN-λ(chIFN-λ)在体内、外对禽Ⅰ群腺病毒4型(FAdV-4)GX2013株和8b型(FAdV-8b)QD2016株感染的抗病毒效果。在体外抗病毒试验中,重组chIFN-λ在LMH细胞上对GX2013株和QD2016株的抗病毒效价分别达到1.33×10^6,1.78×10^6 U/mL。在体内抗FAdV-4感染试验中,重组chIFN-λ治疗组在攻毒5 d后试验鸡存活率达60%,而未进行治疗的对照组3 d内死亡率为100%。在体内抗FAdV-8b感染试验中,重组chIFN-λ治疗组和非治疗组试验鸡均无明显临床症状,但治疗组在攻毒5 d后呼吸道和消化道排毒水平均低于未治疗组,且差异极显著(P<0.01)。上述结果表明重组chIFN-λ作为一种新型的生物制剂,有望在禽腺病毒感染防控中发挥重要的作用。