羊消化道4种易混淆线虫虫卵的形态学观察与比较

为了方便临床上鉴定羊消化道常见且易混淆线虫虫卵并丰富相关资料,试验从羊消化道中采集疑似捻转血矛线虫、夏伯特线虫、食道口线虫和奥斯特线虫共4种线虫,采用形态学和分子生物学方法鉴定虫种,将4种线虫于体外短暂培养后得到纯种虫卵,通过观察虫卵不同发育阶段的胚胎形态变化获取每种线虫虫卵形态特征,并对虫卵的长径、宽径和长宽比进行测定。结果表明:经鉴定4种线虫分别为捻转血矛线虫、绵羊夏伯特线虫、粗纹食道口线虫和普通奥斯特线虫。4种线虫虫卵初期胚胎多呈收缩状态且形似桑葚,在外观形态上具有相似性,均为双层卵壳,多数对称,少数不对称。捻转血矛线虫虫卵呈短椭圆形,颜色较浅;绵羊夏伯特线虫虫卵呈椭圆形,颜色较捻转血矛线虫虫卵深;粗纹食道口线虫虫卵呈长椭圆形,颜色较捻转血矛线虫虫卵深,与绵羊夏伯特线虫虫卵相近;普通奥斯特线虫虫卵亦呈长椭圆形,颜色与捻转血矛线虫相近,较绵羊夏伯特线虫和粗纹食道口线虫虫卵浅。虫卵在生理盐水中培养1~6 d后,捻转血矛线虫、绵羊夏伯特线虫和普通奥斯特线虫依次进入蝌蚪期和幼虫期,但仅凭肉眼依然难以区分虫卵种类;绵羊食道口线虫未观察到含蝌蚪或含幼虫的虫卵,仅在桑葚期观察到胚胎收缩成1团及分裂成2团或3团不同形态的虫卵。部分粗纹食道口线虫和普通奥斯特线虫虫卵可观察到明显的气室。捻转血矛线虫卵大小为(61.22~102.05)μm×(37.96~69.33)μm,长宽比为1.51;绵羊夏伯特线虫卵大小为(81.89~139.14)μm×(43.97~90.60)μm,长宽比为1.57;粗纹食道口线虫卵的大小为(84.57~104.59)μm×(40.86~59.18)μm,长宽比为1.83;普通奥斯特线虫卵大小为(82.83~117.22)μm×(41.70~71.79)μm,长宽比为1.76。说明4种线虫虫卵的外观形态虽有细微差异,但没有特征性标识,临床上易造成误判,因此采用分子生物学方法进行鉴定更为可靠。

绵羊夏伯特线虫对成年牦牛的致病作用及对局部黏膜免疫功能的影响

对自然感染绵羊夏伯特线虫的牦牛(感染组)进行了病理学观察,并同正常牦牛(对照组)进行了比较。结果显示,虫体寄生部位主要在大肠回盲口、盲肠以及结肠前约1/3处,寄生数量为30～50条。寄生部位黏膜增厚,呈脑回样增生,颜色灰白,偶见散在点状出血现象,表面附有较多黏液。黏膜上皮、固有层内肠腺及杯状细胞、浆细胞、弥散淋巴组织均有增生,固有层、黏膜肌层以及黏膜下层可见大量嗜酸性粒细胞浸润,黏膜下层淋巴小结、淋巴集结以及血管周围肥大细胞显著增生,偶见黏膜出血、黏膜上皮坏死脱落等变化。结果表明,肠黏膜脑回样病变实际是由宿主机体自身组织增生所致。成年牦牛对绵羊夏伯特线虫的抗感染能力较强,其原因可能是成年牦牛寄生部位的黏膜相关淋巴组织发育成熟完善,可通过增生加强局部免疫力来抵抗寄生虫的寄生。

绵羊夏伯特线虫外生性发育的研究

把绵羊夏伯特线虫（Ｃｈａｂｅｒｔｉａｏｖｉｎａ）虫卵置于消毒粪便培养基内，于２５℃温箱内及１７℃（±２℃）室内进行培养。结果表明：在２５℃下经４０～４４ｈ第一期幼虫逸出卵壳，６２～６９ｈ完成第一次蜕皮成为第二期幼虫，１６２～１８９ｈ完成第二次蜕皮成为第三期幼虫；第三期幼虫肠细胞呈矩形，共３２个，尾鞘长０．１７５～０，２２０ｍｍ，生殖原基距头端０．３４５～０．３８１ｍｍ；在室内培养的虫卵发育缓慢，约经１０ｄ才发育为第三期幼虫。

绵羊夏柏特线虫线粒体pcox1基因的克隆及序列分析

以从陕西省泾阳县山羊大肠中采集的5条绵羊夏柏特线虫为研究对象,用通用引物JB3及JB4.5扩增绵羊夏柏特线虫的线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因部分序列(pcox1),将测序获得的序列用ClustalX 1.81程序进行比对,并用PAUP程序MP法构建系统发育树。结果表明:所获得的5个绵羊夏柏特线虫样品pcox1序列长度均为393 bp;种系发育分析表明,绵羊夏柏特线虫5个样品位于同一分支,且绵羊夏柏特线虫的pcox1序列种内相对保守(0.5%～2.0%),种间变异显著(9.4%～18.8%),pcox1序列可作为种间变异研究的可靠遗传标记。

绵羊夏柏特线虫和叶氏夏柏特线虫线粒体nad5基因和cytb基因的序列分析

本研究的目的是通过对绵羊夏柏特线虫和叶氏夏柏特线虫线粒体细胞色素b基因（cytb）部分序列（pcytb）和烟酰胺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶亚单位5基因（nad5）部分序列（pnad5）的克隆和遗传变异分析，首次为在分子水平上区分绵羊夏柏特线虫和叶氏夏柏特线虫提供理论依据。采用PCR方法分别克隆了6条绵羊夏柏特线虫陕西分离株和9条叶氏夏柏特线虫青海分离株的pcytb和pnad5。将测序结果应用ClustalX1．81程序进行比对，然后用PAUP4．0程序中的MP法将pcytb和pnad5串联后构建系统发育树。结果显示，获得的pnad5和pcytb序列的长度分别为388bp和659bp，其变异率在绵羊夏柏特线虫分离株中分别为0．3％～1．3％和0．2％～2．6％，在叶氏夏柏特线虫分离株中分别为0～1．8％和0．2％～1．2％，较为保守。但pnad5和pcytb序列在两种间差异率较大，分别为14．7％～16．0％和15．0％～17．39／6。用pcytb和pnad5串联后的序列进行的种系发育分析表明，绵羊夏柏特线虫和叶氏夏柏特线虫分别位于2个分支，支持叶氏夏柏特线虫为独立种；pcytb和pnad5序列可作为夏柏特线虫种间鉴定的遗传标记。