来源于Chaetomium cupreum的几丁质酶chi58基因克隆及特性分析

以角毛壳菌cDNA文库中获得的几丁质酶基因片段(GenBank Accn:DV546055)为基础,用反向PCR技术克隆出该基因的全长cDNA序列,命名为chi58。其开放阅读框(ORF)1602bp,编码533个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为58kD,理论等电点为4.47。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成。经BlastP分析,chi58基因的氨基酸序列的保守性不高,与其相似性最高的是球毛壳菌(Chaetomium globosum XM001230073),相似性为75%。表明该基因是一条新发现的几丁质酶家族基因。该序列已收录于GenBank,登录号为EF026977,DQ886936。

卵孢菌素产生菌株角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-20发酵培养条件优化

卵孢菌素(Oosporein)是具有广谱抗菌活性的二联苯醌类化合物;角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-20为本实验室通过遗传改良获得的卵孢菌素高产菌株.利用该菌株进行发酵条件研究,获得其最适发酵条件为接种量(体积分数)3%、初始p H 7.0、装液量60 mL/250 mL、摇床转速180 r/min、培养温度24℃.培养基碳氮源和无机盐筛选结果表明,15.0 g/L蔗糖、5.0 g/L蛋白粉及0.5 g/L氯化钠能显著提高卵孢菌素产量.以卵孢菌素为响应值,对蔗糖、蛋白粉、氯化钠进行三因素三水平的Box-Behnken实验设计及响应面法优化研究,得到蔗糖、蛋白粉及氯化钠的最佳配比分别为15.63 g/L、5.22 g/L、0.53 g/L,预测在此发酵条件下卵孢菌素最高产量可达2 547μg/mL,实验验证得到卵孢菌素产量为2 478μg/mL,与预测值接近;发酵条件优化后,卵孢菌素产量提高了56.14%.本研究获得了卵孢菌素稳定高产的摇瓶发酵技术参数.

混菌发酵对产纤维素酶的影响及菌剂在大豆秸秆降解中的应用

为提高秸秆还田过程中的腐解效率,减轻还田产生的病害加重现象,以稻草、麸皮为基本培养基,以黄绿木霉菌(拮抗真菌)、角毛壳菌及绿色木霉菌(纤维素高效降解微生物)为研究材料,测定3种不同菌种及混合菌发酵液处理下滤纸酶、棉花酶与羧甲基纤维素酶的活性变化。通过秸秆翻埋试验测定混菌发酵液和商业菌剂处理大豆秸秆发酵前后纤维素、半纤维素含量变化并探讨最适秸秆翻埋长度和深度。探讨混菌培养对纤维素酶产生能力及对大豆秸秆纤维素与半纤维素降解速率的影响。结果表明:滤纸酶活性、棉花酶活性与羧甲基纤维素酶活性均为黄绿木霉菌、角毛壳菌和绿色木霉菌3株菌混菌发酵的产酶能力最强,混合菌发酵的3种纤维素酶活性分别为385. 12,454. 30和495. 12 U。混菌发酵液处理与商业菌剂处理的大豆秸秆粉纤维素与半纤维素含量与空白对照差异显著,混菌发酵液处理的纤维素与半纤维素降解率分别可达66%和76%。大豆秸秆降解率与秸秆强度的变化说明:在大豆秸秆长度为3 cm,翻埋深度为10 cm时,秸秆降解率最高。添加混合菌剂的处理的秸秆降解率较对照提高50%以上,同时秸秆的强度降低约5倍,穿刺力降低。结果证实了3株不同真菌在秸秆降解中复合应用的可行性,可作为大豆秸秆还田中有效的腐解微生物资源。

毛壳菌产抗真菌活性物质菌株的筛选与鉴定

对实验室分离保存的40株毛壳菌菌株代谢产物进行抗真菌活性筛选,5个菌株代谢产物对植物病原真菌具有选择性抑制效果。其中,菌株CH08、CH23发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽菌、小麦根腐菌有较强的抑制作用;菌株CH16、CH17发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽病具有较强的抑制作用;菌株CH21发酵液对西瓜枯萎菌、辣椒炭疽菌有较强的抑制作用。经形态学鉴定,CH08、CH16、CH17、CH23为球毛壳菌,CH21为角毛壳菌。

角毛壳菌CH-1产生的抗真菌活性化合物的纯化和鉴定

对角毛壳菌CH-1进行液体发酵,以辣椒炭疽病菌为指示菌,研究发酵液的理化性质,以减少提取过程中活性化合物的失活,结果表明发酵液在60℃以内,pH 3～5之间活性稳定,乙酸乙酯对活性化合物萃取效果最好.采用活性跟踪分离的方法,运用萃取、正相硅胶层析、结晶、重结晶等技术从发酵液中分离纯化得到纯品.通过紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振谱等波谱学手段鉴定其结构,确定化合物为卵孢菌素,其在防治植物病原真菌方面具有广泛的应用前景.

角毛壳菌产纤维素酶条件的研究

对角毛壳菌(Chaetomium cupreum)产纤维素酶的发酵条件进行了研究.结果表明:Mendels培养基适于角毛壳菌产纤维素酶,CMC酶活可达到15.7 U,β葡萄糖苷酶活达到了15.8 U,滤纸酶活达到12.1 U.最佳产酶碳源是微结晶纤维素.发酵156 h是角毛壳菌产滤纸酶活的最佳时间,达到了14.4 U,发酵180 h是角毛壳菌产CMC酶活和β葡萄糖苷酶活的最佳时间,酶活可分别达到37.6 U和38.4 U.

来源于角毛壳菌的木聚糖酶xyn24基因克隆及特性

利用Blastx将角毛壳菌(Chaetomium cupreum)ESTs与GenBank的Nr数据库进行相似性比对,获得1条编码木聚糖酶基因的全长cDNA序列的EST(GenBank Accn:DV547992),依据该序列设计并合成引物,以角毛壳菌基因组为模板进行PCR扩增,获得角毛壳菌xyn24的全长DNA序列,该DNA序列全长875 bp,由1个内含子和2个外显子组成;cDNA序列全长690 bp,编码229个氨基酸,蛋白质的相对分子质量为24700,理论等电点为7.83。经BlastP分析,xyn24基因的氨基酸序列的保守性不高,与嗜热革节孢菌(Scytalidium thermophilum AB114442)中的木聚糖酶基因的同源性最高,为78%,故推测该基因可能是1条新发现的木聚糖酶家族基因,该序列已收录于GenBank,登录号为:DQ886937,EF026978。

以抗生素抗性为选择标记的毛壳菌种间原生质体融合

以抗生素抗性为选择标记进行角毛壳菌和球毛壳菌种间原生质体融合。角毛壳菌CH21－I－402菌株对潮霉素有抗性、对G418敏感，球毛壳菌CH08对潮霉素和G418敏感。根癌农杆菌介导的新霉素磷酸转移酶基因转化球毛壳菌，得到成功转化新霉素磷酸转移酶基因的球毛壳菌菌株，转化子对G418抗性提高3～4倍，对潮霉素仍然比较敏感。以耐潮霉素、不耐G418的角毛壳菌和不耐潮霉素、耐G418的球毛壳菌为出发菌株，以PEG6000为助融剂进行原生质体融合，用G418和潮霉素抗性进行筛选，获得再生菌株。经AFLP分析表明：再生菌株PF1、PF26为融合菌株，融合菌株菌落形态均与亲本存在明显差异。

角毛壳菌几丁质酶基因chi58多点突变及在毕赤酵母中的高效表达

应用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,gene SOEing),简称SOE-PCR对角毛壳菌(Chaetomium cupreum)的几丁质酶基因chi58进行多点突变。依据毕赤酵母密码子偏爱性,将毕赤酵母中编码Arg使用频率几乎为0的密码子CGC突变为使用频率高的AGA,构建了含有正确突变的酵母表达载体pPIC9K-chi58A,电转化毕赤酵母GS115,获得的重组酵母株在诱导120h酶活力最高,平均可达101.71U/mL±3.33U/mL;其活力比未优化重组酵母株(31.83U/mL±4.85U/mL)提高了约3倍,且经10代传代培养后遗传稳定性良好。表达产物的SDS-PAGE分析表明,酶蛋白分子大小为58kD。

角毛壳菌木聚糖酶基因xyn24在毕赤酵母中的高效表达及产酶的固定化研究

以生防真菌角毛壳菌(Chaetomium cupreum)菌丝体时期的基因文库为基础,筛选得到编码木聚糖酶基因的片段,经拼接及RT-PCR扩增得到全长690bp的编码β-1,4-木聚糖酶基因序列,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达的木聚糖酶重组载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,表达蛋白分泌到培养基中,分子质量约为19.4 ku;以水溶性壳聚糖为底物测得酶活为2.72 U/mL。SDS及金属离子Mn2+对酶活性具有较强的激活作用;转化子经10代传代培养后酶活性稳定。通过制备的壳聚糖微球对木聚糖酶进行了固定化研究,并与游离酶的性质进行了比较。结果表明:固定化酶的最适pH范围与游离酶相比向酸性方向偏移;固定化酶的最适反应温度、酸碱稳定性及热稳定性均有所提高。

角毛壳菌泛素结合酶基因的克隆和特性分析

利用BlastX将角毛壳菌(Chaetomium cupreum)几丁质诱导的菌丝体cDNA文库中的ESTs序列与NCBI的Nr(Non-redundant)数据库进行相似性搜索,获得泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme,E2)基因的ESTs.以此结果设计引物进行RT-PCR,克隆该基因的cDNA序列(CcE2).该序列长600bp,开放阅读框444bp,编码147个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为16.6ku,是亲水性蛋白.BlastP分析表明该基因进化相当保守,与其他真菌的E2具有高度的相似性;三维结构分析显示CcE2仅包含一个功能结构域,在结构域的中央是决定CcE2活性的半胱氨酸残基活性位点.

角毛壳菌几丁质酶诱导cDNA文库的构建

应用EST技术,已经获得了角毛壳菌(Chaetomium cupreum)生长过程中的生防相关基因.在此基础上,利用几丁质为唯一碳源,诱导角毛壳菌几丁质酶及其相关基因的表达,构建了cDNA文库.以角毛壳菌菌丝体为材料,提取纯化mRNA.以mRNA为模板,逆转录合成cDNA双链.与EcoRI接头连接后,收集大于700 bp的cDNA片段与载体pbluscriptⅡsk+连接,转化.未扩增文库的滴度是1.02×106pfu/mL,重组率达95.3%.PCR结果证明cDNA插入片段大于700bp的占94%以上,平均插入片段大于1.5 kb.所构建的几丁质酶诱导cDNA文库质量较高,可用于进一步筛选角毛壳菌的几丁质酶基因及其生物防治相关基因.

苯并咪唑类抗性基因Ben^r在角毛壳菌中的转化

为提高角毛壳菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性,利用聚乙二醇介导的原生质体转化方法,以pBT6质粒为载体,把苯并咪唑类抗性基因Benr转化到角毛壳菌原生质体中,转化率约为1.5×10-5。通过Southern印记杂交分析,证明得到的转化子是阳性转化子。转化子对植物病原菌立枯丝核菌、杨树叶枯病菌有较强的抑制效果,能在多菌灵质量浓度为60μg/mL的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长。其抗药性比野生角毛壳菌提高约100倍,并且抗药性能够稳定遗传。研究获得了具有苯并咪唑类杀菌剂抗药性的角毛壳菌转化子。

角毛壳菌降解粗纤维基因的筛选

以角毛壳菌菌丝体为材料,构建cDNA文库并进行了部分表达序列标签(ESTs)的分析。文库的滴度为1.02×106pfu/mL,重组率为95.3%,插入片段平均长度大于1.2kb。在cDNA文库中随机选择克隆从5′端测序得到1219个高质量ESTs,拼接为804条独立基因。其中460条(57.2%)与NCBI中非冗余蛋白质库(NR)已知基因有不同程度同源性的代表已知功能基因,344(42.8%)条独立基因与NR库中基因没有显著同源性的代表未知功能新基因。从已知基因中鉴定出了降解粗纤维的基因:β-1,4-内切葡聚糖酶基因、β-葡萄糖苷酶基因、β-内切木聚糖酶基因、木糖苷酶基因、漆酶基因。

产抗生素角毛壳菌CH21的诱变育种

以角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21的萌发孢子作为诱变材料,采用微波辐照和紫外线照射进行诱变处理,用辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)作为测试菌株,结合PDA双层平板法初筛和管碟法复筛,选育高产抗生素的突变株。结果表明:最佳微波诱变条件为500W、2450MHz、15s,紫外诱变条件为15W、30cm、300s。对出发菌株CH21进行一轮微波诱变和一轮紫外诱变,筛选得到5株高产菌株,其中CH21-2-20抑菌圈直径最大,为20.20mm,较抑菌圈直径为12.50mm的出发菌株增大了62%。连续传代5次,CH21-2-20抑菌圈直径稳定在19.40～20.38mm。