The Development and Application of an Indirect ELISA Test for the Detection of Chicken Anaemia Virus (CAV) by VP1 in Chicken Flock Serum

Chicken anaemia virus (CAV) causes a viral disease in chickens worldwide and thus has economic importance. The main aim of this study was to develop a rapid, sensitive and specific VP1-CAVI indirect ELISA for the detection of CAV infection. The CAV-VP1, was separately cloned and expressed in recombinant E. coli. The purified recombinant CAV-VP1 protein was then coated as an antigen on an ELISA plates to evaluate its reactivity against chicken sera. The resulting indirect ELISA was then compared with a commercial ELISA. The specificity and sensitivity of the indirect ELISA were measured as 93.3% and 100%, respectively. A t-test produced a t-value of 15.805 for the indirect ELISA and revealed a significant difference between CAV-positive serum and CAV-negative serum (p-value of 0.001). For the second variable (i.e., a commercial ELISA), the t-test yielded a t-value of 5.063, which revealed a significant difference between CAV-positive serum and CAV-negative serum (p-value of 0.015). This intervention produces statistically significant improvements in both variables (p-values < 0.05). The correlation coefficient for the indirect ELISA was r = 0.93. Therefore, this work can be considered as a new achievement in diagnosis for Chicken anaemia virus in chicken flocks.

传染性法氏囊病病料中MDV、CAV、REV的共感染检测

从江苏、山东、浙江、河南、上海、广西、云南等地收集根据临床表现及病理变化诊断为传染性法氏囊病( IBD)的病鸡法氏囊样品 66份 ,用相应的核酸探针及斑点杂交法分别检测样品中鸡传染性贫血病病毒( CAV)、马立克氏病病毒 ( MDV)、网状内皮细胞增生病病毒 ( REV)的感染 ;用抗 IBD血清做琼扩检测 IB-DV。结果显示 ,部分地区病料中这些病毒有不同程度的二重感染、三重感染甚至四重感染。提示在研究特定毒株 IBDV的毒力时 ,应考虑多重感染对致病性的影响。

CAV与REV共感染SPF鸡对疫苗免疫反应的抑制作用

用1日龄SPF鸡人工感染鸡贫血病毒(CAV)和禽网状内皮增生病病毒(REV),探讨病毒感染对鸡体疫苗免疫反应的影响。结果表明,在用禽流感病毒(AIV,H5和H9)疫苗免疫后,CAV与REV单独感染均显著抑制了鸡体对H5和H9亚型禽流感病毒灭活疫苗的HI抗体反应,在CAV与REV共感染后,这种抑制作用更为明显。CAV单独感染后鸡体对新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)疫苗的免疫反应受到抑制,但与对照组在统计学上的差异不显著,然而,CAV可以显著加重REV感染对鸡体在NDV和IBDV疫苗免疫后抗体反应的抑制作用。从而证实CAV与REV共感染在疫苗免疫抑制上有协同作用。

我国部分地区蛋鸡群ALV-J及与REV、MDV、CAV混合感染检测

为了解J亚群禽白血病病毒(ALV-J)及其与禽网状内皮细胞增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)和鸡传染性贫血病病毒(CAV)的混合感染现象,本研究从宁夏、湖北、广东、山东、辽宁、吉林、黑龙江7个省的39个蛋鸡群收集临床表现和剖检病理变化疑似禽白血病的病料样品184份,采用PCR、病毒分离和IFA检测样品中ALV-J、REV、MDV和CAV。结果表明,7个省蛋鸡场均存在ALV-J感染,病料样品阳性率为60.9%,检测鸡群阳性率为82.1%,与REV、MDV、CAV的混合感染率分别为13.6%、24.5%、22.8%,其中存在较为严重的双重感染(29.0%)和3重感染(18.8%),甚至4重感染(1.7%)。研究结果表明,我国蛋鸡群中普遍存在ALV-J感染,而且与REV、MDV、CAV混合感染严重;提示ALV-J已经可以引起蛋鸡群发病,在临床诊断和致病性研究中,应考虑到多重感染的影响。

用斑点杂交法同时检测鸡群中的CAV MDV和REV

为研究鸡传染性贫血病毒(CAV)在鸡群中的感染状况以及马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮细胞增生病病毒(REV)在鸡群中的发病率,用斑点杂交法对山东省4个肉鸡场和2个肉种鸡场进行CAV、MDV和REV的检测,结果表明除一个肉种鸡场没有检测出REV以外,其他鸡场均同时检测出CAV、MDV和REV,并且发现直接从病料中检测CAV的阳性率(20％)远远低于将病料接种SPF鸡胚后的检出率(80％)。

我国自然发病鸡群中MDV、REV和CAV共感染的检测

从山东、河南、河北、北京、江苏、广东、广西、四川、吉林、辽宁、台湾11 省42 个不同鸡群收集临床有发病表现的828只病、死鸡的病理组织样品,用点杂交方法检测各个样品中马立克氏病病(Marek′s disease virus,MDV)、网状内皮细胞增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV) 、鸡传染性贫血病病毒(Chicken anemia virus,CAV)的感染情况。结果表明:828 只病鸡中这三种病毒的检出率均相当高,分别为83. 94% (MDV)、61. 0% (CAV)和57.25%(REV),并且存在非常严重的双重感染(31. 16%)和三重感染(44. 69%),单重感染和阴性个体仅占15.34%和8.82%;在42个鸡群中的29个存在三重感染,占鸡群总数的69.05%,5个鸡群存在MDV和CAV的共感染,3个鸡群存在MDV和REV的共感染,二重感染占鸡群总数的19.05%,仅有2个鸡群未检测到这三种病毒;在地域分布上,11个省份均检测到了MDV、CAV和REV,表明了这三种病毒在我国的广泛分布及其在生产鸡群中的混合感染是导致当前我国养禽业生产性能下降、条件致病性疾病发生严重、临床腺胃肿大症状发生的重要原因。

CAV对BWEL-SPF鸡的致病性试验及毒价测定

本实验用鸡传染性贫血病病毒标准株 (CAV和Cux_1)和国内分离株 (CAVM990 5CAV和H990 6 )分别对BWEL_SPF雏鸡 1～ 7家系进行 1日龄和 1月龄攻毒的致病性试验。 1日龄雏鸡接种CAVCux_1毒株 ,12天后观察到感染鸡的喙、腿、冠和爪等部位颜色变浅 ,16天剖杀 ,观察剖检变化 ,并进行IFA和PCR检测 ,确定感染率和CAV毒价。结果CAVCux_1株对 1日龄BWEL_SPF雏鸡半数感染量 (CID50 )为 10 4 .3 / 0 .2ml。同时检测到CAVCux_1株对 1月龄BWEL_SPF雏鸡发病率为 6 0 %;CAVM990 5和CAVH990 6对 1日龄BWEL_SPF雏鸡发病率为 10 0 %,死亡率为 40 %、2 0 %。

PCR和斑点杂交检测鸡传染性贫血病毒

通过聚合酶链反应（ｐｃＲ）扩增鸡传染性贫血病毒（ｃＡＶ）ＤＮＡ特定片段，将此ｐｃＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记后作为探针进行斑点杂交，以此检测ＣＡＶ并作流行病学调查。对从江苏省不同地市随机采集的２月龄左右不同疾病的病鸡ＤＮＡ样品进行检测，在被检的５２个不同鸡群来源的病料中，有３６个鸡群来源的病料ＤＮＡ显示ＣＡＶ阳性（群阳性率为６９．２％）；备组织中ＣＡＶＤＮＡ含量有所差异，依次为胸腺＞脾、骨髓、肝＞肾、法氏囊、脑。用ＰＣＲ检测得到的阳性鸡的组织病料感染ＳＰＦ鸡，在感染后第２４天检查，出现贫血症状。初步调查表明，在江苏一些地区ＣＡＶ感染已相当普遍，但它与发病的关系还有待于进一步研究。

第46代鸡贫血病病毒细胞凋亡素基因的体外扩增、克隆、序列比较

通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增了第 46代鸡贫血病病毒 (CAV)Cux株的细胞凋亡素 (Apoptin)基因 ,并克隆入pGEX_5X_3质粒载体中。通过限制性内切酶分析、序列测定 ,验证了克隆的正确性。细胞凋亡素基因全长为 36 3bp ,编码 12 1个氨基酸。与Meehan .等发表的CAVCux株序列相比 ,第 46代细胞适应毒的细胞凋亡素基因的第 2 0 9个核苷酸由CT ,与澳大利亚株、美国株CAV序列分别有 5个和 2个碱基的差别 ,并且均匀分布在 5’端前 2 10碱基区 ,而在 3’端序列较为保守。与同处欧洲的英国株CAV序列相比 ,序列较为一致。本研究对所克隆的调亡素编码蛋白进行了疏水性分析和抗原表位优势分析。

鸡贫血病毒VP1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物学特性的初步分析

将鸡贫血病毒 (CAV)VP1蛋白 44 9个氨基酸中的 42 4个氨基酸 (占 95 % )编码序列分二段 ,分别克隆入表达性载体 pGEX - 5X - 3,在大肠杆菌以GST融合蛋白的形式获得了高效表达。以表达产物免疫小鼠 4次 ,制备了抗CAV的多克隆抗体。通过对CAV感染的MSB1细胞做间接免疫荧光试验 (IFA) ,结果为阳性。这表明表达物保留了天然VP1相关的抗原性。用此抗CAV抗体和所建立的IFA方法对临床CAV凝似病料成功地进行了实验室诊断。

SP-TAT-Apoptin融合蛋白对HepG2细胞周期的影响

目的:研究SP-TAT-Apoptin融合基因诱导人肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期阻滞,探讨其用于肝癌治疗的可能性。方法:通过DNA重组技术,以pcDNA3.1/Apoptin质粒11为模板,构建SP-TAT-Apoptin融合基因plenti6-V5-D-TOPO真核表达载体。用SP-TAT-Apoptinplenti6-V5-D-TOPO真核表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),转染后Blasticidin霉素进行筛选,并进行鉴定得到稳定表达SP-TAT-Apoptin的CHO细胞株。收集含有TAT-Apoptin融合蛋白的筛选细胞培养上清,用于HepG2细胞培养。于共培养后的不同时段收集HepG2细胞,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期。结果:用包含SP-TAT-Apoptin融合基因的plenti6-V5-D-TOPO真核表达载体瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),成功筛选出稳定表达SP-TAT-Apoptin融合蛋白的CHO细胞,收集细胞培养上清,继续用于HepG2细胞培养,可观察到HepG2细胞阻滞于G1期并引起细胞凋亡。结论:SP-TAT-Apoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞。

用PCR扩增和克隆鸡贫血病毒衣壳蛋白VP_2基因

接种鸡贫血病毒（ＣＡＶ）Ｃｕｘ１毒株于ＭＤＣＣＲＰ１细胞中，并用经狄高辛标记的ＣＡＶ衣壳蛋白ＶＰ１基因克隆ＤＮＡ作为探针在斑点杂交中检测和比较了各代细胞中ＣＡＶＤＮＡ水平．通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ），从ＣＡＶＤＮＡ水平较高的ＭＤＣＣＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中扩增出ＣＡＶ衣壳蛋白ＶＰ２基因片段约６５０ｂｐ的编码序列，将该ＰＣＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎＩ位点克隆到ｐＵＣ１９质粒载体中，酶切分析筛选到含ＣＡＶＶＰ２基因的重组质粒ｐＣＶＰ２，并进一步进行了酶切鉴定，ＤＮＡ序列分析表明所克隆到的ＶＰ２基因与已发表的该基因序列基本一致，且读框正确．

一株鸡传染性贫血病毒野毒株致病性及其全基因组序列比较

从山东某商品代肉鸡场表现生长迟缓的14日龄病鸡群分离到一株鸡传染性贫血病毒（CAV）C14株。C14株感染1日龄SPF鸡能抑制对禽流感病毒（AIV）的抗体反应,还能与禽网状内皮增生病病毒（REV）在免疫抑制上起协同作用。用PCR方法分段扩增出C14基因组的三条部分重叠片段,分别克隆于T载体并进行测序,拼接后得到其全基因组序列。测序结果表明,CAV-C14株基因组全长2298bp,含有3个互相重叠的开放阅读框和1个调控区。将C14与国内外已发表的CAV参考株基因组比较,同源性为97.2%~99.2%。序列比较表明CAV非编码区中含有的多个与复制及转录调控相关已知基序的序列都非常保守。CAV的3个编码基因VP1、VP2和VP3均有一定程度变异,以VP1变异性最大,且不同毒株间的3个蛋白质氨基酸序列的变异是互不相关的。

2种鸡免疫抑制性疾病LAMP检测方法的建立

本文借助环介导等温扩增技术(LAMP),建立了两种常见鸡免疫抑制病的(鸡传染性贫血病、J亚群白血病)的快速检测方法。采用简易法提取DNA模板,设计特异性LAMP引物,成功扩增出梯形条带,并且对反应体系进行优化,以及特异性试验和灵敏度试验。结果表明LAMP的灵敏度可达10个拷贝,比PCR灵敏度高10倍;且具有特异性,对其他相关鸡病病原检测结果均为阴性。用建立的LAMP方法对临床样品进行检测,同时与PCR方法比较,结果表明LAMP结果基本与PCR相符,但检测的阳性率要比PCR高。操作简便,无需昂贵设备,适用于临床快速诊断。

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列，分别在鸡贫血病毒（ＣＡＶ）环形基因组ＤＮＡ（全长２．３ｋｂ）的ＥｃｏＲＩ位点和ＢａｍＨＩ位点的两侧选择适当序列合成两对引物，用ＰＣＲ技术，从斑点杂交检测到病毒核酸的ＣＡＶ感染的ＭＤＣＣＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中，分别扩增出包含ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ分割开的病毒基因组两部分（１．５ｋｂ和０．８ｋｂ）约１．５ｋｂ和约１．２５ｋｂ的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进ｐＵＣ１８载体，获得包含ＣＡＶ全基因组序列ＤＮＡ片段的克隆质粒ｐＣＡＶ２．４。酶切分析表明，该质粒具有预期的ＢａｍＨＩ位点、ＰｓｔＩ位点、ＨｉｎｄⅢ位点，而预期的ＥｃｏＲＩ位点消失。重组质粒插入ＤＮＡ片段的两端序列分析表明，质粒ｐＣＡＶ２．４是包含ＣＡＶ全基因组序列的重组质粒，插入ＤＮＡ片段序列中的ＥｃｏＲＩ位点序列发生了一个碱基突变。

鸡传染性贫血病毒与马立克氏病病毒共感染SPF鸡群免疫抑制协同作用的研究

将鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV or CAV)和马立克氏病病毒(Marek s dis-ease virus,MDV)人工单一和共同感染1日龄的SPF鸡,感染后分别于14、21、28、35日龄检测鸡体红细胞压积的变化,并检测鸡群疫苗免疫3周后的抗体反应,以探讨CAV与MDV共感染对鸡体的免疫抑制是否有协同作用。结果表明,在血液分析方面,CAV与MDV共感染组较病毒单一感染组与对照组差异极显著,共感染不仅加重了鸡群贫血现象,而且延长了贫血的病理症状;而在禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)H5/H9疫苗、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)疫苗和传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)疫苗免疫后3周的抗体检测中,CAV与MDV共感染组较其它各实验组差异极显著,抗体滴度大大低于其它实验组;此外,CAV与MDV共感染组,鸡体生长状况明显差于实验各组,有6只鸡只死亡(6/25),比病毒单一感染时的死亡率大大增加。综上研究证明,CAV与MDV共感染在免疫抑制作用上有协同作用。

鸡贫血病毒VP1和VP2蛋白在家蚕中的联合表达

将鸡贫血病毒 VP1和 VP2基因分别克隆入转移载体 p Bac PAK8中 ,获得重组转移质粒 p Bac-vp1和 p Bac-vp2。以上两质粒分别与Cvn 酶切线性化的亲本病毒 Bm-Bac PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,通过蓝白斑筛选 ,纯化得到重组病毒 Bm-vp1和 Bm-vp2。PCR分析表明 Vp1和 Vp2基因已整合进杆状病毒基因组中。将 Bm-vp1和 Bm-vp2共感染 5龄家蚕 ,通过表达产物免疫 SPF鸡产生的抗血清与 CAV感染的 MDCC-MSB1细胞的间接荧光抗体分析 ,证明表达产物能诱导鸡产生相应的抗体。该研究表明 ,表达 VP1和 VP2蛋白的重组家蚕杆状病毒 ( recombinant Bm NPV)

鸡贫血病毒细胞凋亡素基因的原核表达及其免疫学活性

将鸡贫血病毒 (CAV)细胞凋亡素基因克隆入表达性载体 p GEX- 5 X- 3,在大肠杆菌中以融合蛋白的形式获得表达。再以表达产物免疫小鼠 ,制备抗 CAV凋亡素的多克隆抗体。以其对 CAV感染的 MSB1细胞作间接免疫荧光试验(IFA)检测呈阳性 ,表明表达产物保留了其相关的天然抗原特性。

鸡贫血病毒全基因组点突变体的体外构建及其在宿主细胞MSB1的转染研究

在已构建鸡贫血病毒 (CAV)全基因组体外克隆 (pCAV2 4)的基础上 ,设计一对特定引物 ,用PCR定向点突变方法扩增出含有完整的EcoRI位点的CAV全基因组 (2 3kb) ,并克隆入pUC18载体中 ,获得阳性克隆 ,命名为pCAVE+ 。经酶切鉴定和序列分析EcoRI位点两侧序列 ,原先不完整的EcoRI位点 ( GACTTC )已被定向点突变为完整的EcoRI位点 ( GAATTC )。对重组质粒pCAVE+ 以EcoRI酶切回收CAV全基因组DNA ,在体外连接并经纯化后 ,经Effectene转染易感宿主细胞MSB1。将转染细胞培养上清连续传代 8次以后 ,出现病毒复制 (MSB1细胞培养基颜色不再变黄 )。取此时细胞培养液感染无CAV的 1日龄SPF小鸡 ,14天出现典型的鸡贫血症状和胸腺萎缩、骨髓脂肪变性等病变。获得了能在体外自主复制并组装成完整CAV病毒子的感染性核酸。

鸡传染性贫血病研究进展

介绍了鸡传染性贫血的流行病学特点,病原、临床症状、诊断方法及临床防治。提出了需要进一步研究的一些问题。