鸡卵清蛋白基因调控序列指导人促红细胞生成素转基因鸡的制备

本研究将鸡卵清蛋白 5!@端调控区调控人促红细胞生成素的pOV -hEPO特异表达载体用脂质体包埋 ,和供体细胞融合后 ,显微注射入 4 5 0枚受体胚盘 ,采用代用蛋壳法培养制备转基因鸡 ,PCR和斑点杂交检测外源基因已整合入早期鸡胚胎生殖系统 。

鸡输卵管生物反应器的研究进展

目前鸡输卵管生物反应器的研究集中在以卵清蛋白调控区来调控外源基因的表达。鸡输卵管生物反应器的研究以输卵管细胞的培养为起点 ,再研究外源基因在输卵管内定位表达的可能性 ,最后制作转外源基因能稳定遗传的转基因鸡。本文对鸡输卵管生物反应器研究作一综述 ,提出了存在的问题并作以展望。

1.1kb、2.7kb、3.0kb鸡输卵管组织特异性启动子的克隆及细胞评价

鸡卵清蛋白基因启动子是指导外源基因高效特异性表达的理想调控区,利用卵清蛋白启动子驱动外源蛋白大量表达,需要包含组织特异性相关序列。本研究以海兰白鸡的基因组为模板,采用PCR扩增了1.1 kb、2.7 kb和3.0 kb的卵清蛋白启动子区,置换pcDNA6.2-GFP中CMV启动子序列,构建了真核表达载体pOV1.1 kb-GFP、pOV2.7 kb-GFP、pOV3.0 kb-GFP;转染原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO),PCR、RT-PCR证明重组载体能够整合到细胞基因组内,并进行转录;倒置荧光显微镜下观测到绿色荧光蛋白表达;启动子表达效率由高到低依次是CMV启动子、1.1 kb、2.7 kb、3.0 kb卵清蛋白启动子。研究结果为瞬时表达模型的建立和输卵管生物反应器的研究奠定基础。

重组人组织激肽释放酶与猪胰腺组织激肽释放酶的理化特性比较

为了研究表达在蛋清中的重组人组织激肽释放酶（rhK1）是否与天然组织激肽释放酶具有相似的理化特性，对鸡输卵管暂态生物反应器表达的rhK1与猪胰腺组织激肽释放酶（pK）的理化特性进行比较鉴定．Western blotting检测结果显示，表达在蛋清中的rhK1能被人组织激肽释放酶（hK1）特异抗体识别，与pK无交叉反应，rhK1酶原和成熟酶的分子量约为43kDa和37kDa．理化鉴定结果显示，rhK1在pH7～10的范围内活性稳定，而pK在pH8～9的范围内活性较稳定；rhK1和pK均能被Cu^2＋、Fe^3＋和Al^3＋完全抑制；rhK1和pK的热稳定性相似，但rhK1在37℃孵育20min后被显著激活、以上试验结果表明，表达在蛋清中的rhK1分子量正确，理化特性与猪的天然酶相似，具有开发利用价值．

转基因鸡生物反应器载体的构建及其表达特性分析

以增强型绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶为报告基因,构建了鸡卵清蛋白启动子表达载体和慢病毒载体,以巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子表达载体为对照,转染或感染鸡原代输卵管上皮细胞、鸡胚成纤维细胞、鼠3T3-L1前脂肪细胞和牛乳腺上皮细胞,通过荧光和酶活性检测,旨在筛选出用于实现转基因鸡生物反应器的高效特异性表达载体。结果发现,鸡卵清蛋白启动子表达载体转染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,没有表现出明显的细胞特异性,且荧光素酶检测结果表明其在各细胞组中表达活性都低于CMV启动子表达载体100倍以上;慢病毒载体感染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,在鸡输卵管上皮细胞组感染单个细胞的病毒颗粒(Multiplicity of infection,MOI)为20时绿色荧光蛋白表达量就可以达到CMV启动子表达载体的水平。上述结果表明,基于卵清蛋白基因调控序列构建的表达载体无法实现外源基因的高效、特异性表达,而慢病毒载体在表达活性和广泛性上可以用于进行鸡输卵管生物反应器的研究。

鸡OV启动子表达HA对禽流感病毒攻击提供完全保护

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体pOV_（1.1k）-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及HA试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPF鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以10~6EID_（50）H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡,免疫组100%存活,无排毒现象,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPF鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护;为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白奠定了基础。