转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽基因小黑杨对杨扇舟蛾的抗性

为评价转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽融合蛋白基因小黑杨对杨扇舟蛾Clostera anachoreta(Fabricius)的抗性,采用苗木套笼饲喂法和石蜡切片法,对取食转基因小黑杨的杨扇舟蛾幼虫的发育、死亡情况和中肠结构进行了研究。结果表明,杨扇舟蛾幼虫分别取食TT3(转基因无性系3)、TT1(转基因无性系1)和CK(非转基因对照)小黑杨后总历期依次为35.63天、30.39天和28.74天,幼虫化蛹率依次为12.1 %、29.3 %和44.3 %,平均蛹重依次为0.1077g、0.1714 g和0.1893 g。转基因小黑杨能明显延长杨扇舟蛾幼虫的发育历期,降低化蛹率和蛹重。同时,转基因小黑杨有抑制幼虫蜕皮、增加其死亡率和致蛹畸形的作用,且能破坏幼虫中肠,使中肠细胞排列松散、肠腔食物减少、中肠变形,其破坏作用随时间延长而加剧。一般来讲,TT3对杨扇舟蛾的各种影响作用均大于TT1。

欧美杨108号转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白嵌合基因转化系统的建立

通过除菌抗生素的筛选试验、叶片对头孢唑啉钠的敏感试验、叶片对卡那霉素的敏感度试验、茎段对卡那霉素的生根敏感试验,成功建立了欧美杨108号转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白嵌合基因的转化系统。转化时所选的除菌抗生素为注射用头孢唑啉钠;除菌时,头孢唑啉钠的质量浓度为1000mg/L;在筛选转化体时,卡那霉素的临界质量浓度确定为30mg/L;确定了生根培养基中卡那霉素的临界质量浓度为20mg/L。欧美杨108号转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白嵌合基因转化系统的成功建立为该杨树品种的基因工程提供了前提条件。

蜘蛛杀虫肽与Bt-toxin C肽融合蛋白(BGT)基因的原核表达与蛋白质纯化

从质粒pCAMBIA2301-BGT中获得蜘蛛杀虫肽与Bt-toxin C肽融合蛋白(BGT)基因编码区全长,并构建了原核表达载体pET28a-BGT。将此质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得有效表达,新蛋白的分子量约为51 kDa,主要以包涵体形式存在。在变性条件下以不同的咪唑和pH值洗脱方式进行比较,确定以咪唑为金属鳌合亲和柱层析的洗脱条件,获得了纯BGT蛋白。

转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽基因小黑杨对舞毒蛾中肠组织结构的影响

采用透射电镜观察舞毒蛾幼虫取食转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽融合蛋白基因小黑杨叶片后,其中肠组织的病理变化。结果发现,转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽融合蛋白基因小黑杨,能够引起舞毒蛾幼虫中肠组织发生明显的病理变化,致使幼虫中肠组织受到严重破坏。幼虫中肠组织中,柱状细胞、杯状细胞结构发生明显的病理变化,并随着取食的时间和取食量的增加,其病变和破坏的程度逐渐加剧。

转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽基因小黑杨对分月扇舟蛾中肠组织结构的影响

采用透射电镜观察,取食转蜘蛛杀虫肽与B t毒蛋白C肽融合蛋白基因小黑杨叶片后的分月扇舟蛾幼虫的中肠组织病理变化,结果发现:幼虫中肠组织受到严重破坏,柱状细胞、杯状细胞结构发生明显的病理变化;随着取食时间和取食量的增加,其病变和破坏的程度逐渐加剧。