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Three-dimensional structure of the Chinese Sacbrood bee virus 被引量:1
1
作者 张景强 冯建勋 +4 位作者 梁玉尧 谌东华 周正洪 张勤奋 卢炘英 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS 2001年第4期443-448,共7页
The RNA of Chinese Sacbrood Bee Virus (CSBV) was purified and used as template to obtain a 1096 bp cDNA fragment by RT-PCR amplification. This DNA fragment was cloned into pGEM-T Easy Vector for sequencing. Analyses o... The RNA of Chinese Sacbrood Bee Virus (CSBV) was purified and used as template to obtain a 1096 bp cDNA fragment by RT-PCR amplification. This DNA fragment was cloned into pGEM-T Easy Vector for sequencing. Analyses of the sequenced CSBV RNA fragment revealed a nucleotide sequence homology of 87.6% and a deduced amino-acid sequence homology of 94.6% with that of the Sacbrood Virus (SBV), indicating that CSBV is a different but highly homologous virus of SBV. The three-dimensional (3D) structure of CSBV was determined at 2.5 nm resolution by using electron cryo-microscopy (cryoEM) and computer reconstruction methods. The 3-D structure showed that the capsid has a T= 1 (or P= 3) icosahedral capsid shell with a smooth surface. There were 12 pentons at its icosahedral vertices (5-fold axes) and 132 holes penetrating the shell. The 3-D structure also revealed densities corresponding to the CSBV genome, suggesting icosahedrally-ordered RNA organization, a novel feature not previously reported for any picornavi-ruses. 展开更多
关键词 chinese sacbrood virus (csbv) sequence three-dimensional structure ELECTRON cryo-microscopy.
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中蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)核酸的结构研究(英文) 被引量:10
2
作者 张勤奋 杨艺峰 +2 位作者 梁玉尧 卢英 张景强 《电子显微学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期331-334,共4页
本文分别应用冷冻电镜与计算机三维重构技术和分子生物学技术对中蜂囊状幼虫病病毒 (CSBV)的核酸的三维结构和核酸一级结构进行测定和分析 。
关键词 中蜂囊状幼虫病病毒 核酸 一级结构 三维结构 csbv 冷冻电镜 蜜蜂 计算机三维重构 分子生物学
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中蜂囊状幼虫病病毒特异性半套式RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:14
3
作者 沈克飞 曹兰 +3 位作者 付利芝 任勤 姬聪慧 王介平 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第12期39-42,共4页
基于中蜂囊状幼虫病病毒基因组序列AF469603中的RNA依赖的RNA聚合酶基因,建立该病毒的半套式RT-PCR检测方法。利用建立的方法检测有典型临床症状的病死中蜂幼虫,可扩增到特异的目的片段,序列分析得出,PCR扩增片段与AF469603同源性高于9... 基于中蜂囊状幼虫病病毒基因组序列AF469603中的RNA依赖的RNA聚合酶基因,建立该病毒的半套式RT-PCR检测方法。利用建立的方法检测有典型临床症状的病死中蜂幼虫,可扩增到特异的目的片段,序列分析得出,PCR扩增片段与AF469603同源性高于97%,与其他病原无同源性,表明该方法可用于临床诊断和流行病学研究。 展开更多
关键词 中蜂 囊状幼虫病病毒 半套式RT—PCR
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中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因的克隆及序列分析 被引量:5
4
作者 冯建勋 余健秀 张景强 《中山大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 1999年第5期124-126,共3页
根据小RNA 病毒科( Picornaviridae) 中病毒RNA 所具有的结构特征, 采用mRNAcapture kit 提取纯化中蜂囊状幼虫病病毒(Chinesescabrood virus CSBV) 的RNA, 并以... 根据小RNA 病毒科( Picornaviridae) 中病毒RNA 所具有的结构特征, 采用mRNAcapture kit 提取纯化中蜂囊状幼虫病病毒(Chinesescabrood virus CSBV) 的RNA, 并以之为cDNA合成的模板. 依据小RNA病毒科中的脊髓灰质炎病毒结构蛋白基因序列设计了一对引物VP5和VP3 , 通过PCR 扩增获得预期大小约为1 100 bp的DNA 片段, 将此片段克隆到pGEMTeasy载体上并直接测序. 序列分析表明, 该片段为中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因, 与意蜂幼虫囊状病病毒结构蛋白基因序列的同源性为86-8 % , 与之对应氨基酸序列的同源性高达93-4 % . 展开更多
关键词 中蜂 囊状幼虫病 病毒 csbv 结构蛋白 基因克隆
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中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白预测与鉴定 被引量:4
5
作者 马鸣潇 马臣 +3 位作者 程健 谢振声 李明 费东亮 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2011年第8期1768-1773,共6页
采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法、生物信息学软件和质谱分析对中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)辽宁株(CSBV-LN)全基因组进行了分子克隆、序列测定、分子生物学特性分析及结构蛋白预测和鉴定.结果表明,CSBV-LN全基因组序列长度为8863个核苷... 采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法、生物信息学软件和质谱分析对中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)辽宁株(CSBV-LN)全基因组进行了分子克隆、序列测定、分子生物学特性分析及结构蛋白预测和鉴定.结果表明,CSBV-LN全基因组序列长度为8863个核苷酸,编码一个大的开放阅读框,其中包括178 nt的5'非编码区的前导序列和79 nt的3'非编码区,后面跟着一个poly(A)的尾巴.通过软件分析表明,CSBV-LN蛋白序列类似于哺乳动物的小RNA病毒蛋白序列,预计存在VP1,VP2,VP3和VP4等4个小的结构蛋白;系统进化分析表明,CSBV、囊状幼虫病毒(SBV)和残翅病毒(DWV)的起源相同,推测CSBV有着类似DWV的结构蛋白序列5'-VP2-VP4VP1VP3-3.基于此,根据PAGE蛋白条带的大小,利用NetPicoRNA软件预测结构蛋白的裂解位点.在此基础上,对纯化后的CSBV进行SDS-PAGE分离,对分离到的4个蛋白进行质谱分析,结果鉴定出VP1,VP3和VP0 3个蛋白. 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病毒 反转录聚合酶链反应 结构蛋白 质谱分析
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中华蜜蜂幼虫原代细胞培养及中华蜜蜂囊状幼虫病毒在培养的细胞中的复制 被引量:2
6
作者 李慧 费东亮 +1 位作者 胡影 马鸣潇 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1362-1367,共6页
【目的】建立一种适用于蜜蜂源的细胞培养方法,为蜜蜂源细胞培养和蜂病毒的研究奠定基础。【方法】比较在Grace和WH2两种昆虫细胞培养基中培养的中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫原代细胞状况,筛选出适用于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养的最... 【目的】建立一种适用于蜜蜂源的细胞培养方法,为蜜蜂源细胞培养和蜂病毒的研究奠定基础。【方法】比较在Grace和WH2两种昆虫细胞培养基中培养的中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫原代细胞状况,筛选出适用于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养的最佳培养基,并通过细胞活力比较,确定用于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养的适宜胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)浓度。在此基础上,用该原代细胞接种中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood bee disease,CSBV),并通过实时定量RT-PCR方法对病毒复制情况进行检测。【结果】相对于WH2培养基,在Grace培养基中生长的细胞大而圆,透明,边缘整齐,无颗粒物,活力明显高于WH2培养,且含15%FBS的Grace培养基更适合于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养。CSBV接种在该原代细胞,能够复制增殖,同时伴随宿主细胞快速分裂。【结论】中华蜜蜂幼虫原代细胞培养基在含15%FBS的Grace中能够良好生长,并且CSBV可以在该原代细胞中进行复制。 展开更多
关键词 中华蜜蜂 中华蜜蜂囊状幼虫病毒(csbv) 原代细胞培养 胎牛血清(FBS) 实时定量RT-PCR
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陕北中蜂囊状幼虫病抗病品系的选育 被引量:3
7
作者 高宝国 高崇东 +3 位作者 鲍亚利 田慧宇 张亚宁 刘新宇 《畜牧兽医杂志》 2012年第3期25-27,共3页
中华蜜蜂,简称中蜂。是我国独有的蜂种,囊状幼虫病是目前危害中华蜜蜂最主要的病害。试验以囊状幼虫病流行后自愈的蜂群为基础选育素材,采用人为感染、逐级淘汰、闭锁繁育、固定有益基因的育种手段,进行中蜂囊状幼虫病抗病品系的选育,... 中华蜜蜂,简称中蜂。是我国独有的蜂种,囊状幼虫病是目前危害中华蜜蜂最主要的病害。试验以囊状幼虫病流行后自愈的蜂群为基础选育素材,采用人为感染、逐级淘汰、闭锁繁育、固定有益基因的育种手段,进行中蜂囊状幼虫病抗病品系的选育,大大地提高了其抵抗囊状幼虫病的性能。 展开更多
关键词 中华蜜蜂 囊状幼虫病 抗病选育 闭锁繁育
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中蜂雄蜂精液与工蜂中蜂囊状幼虫病毒的检测
8
作者 宋文菲 杨爽 +2 位作者 苗春辉 梁铖 张学文 《动物医学进展》 北大核心 2017年第2期64-67,共4页
为了解同群中蜂雄蜂精液及工蜂中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的感染情况,寻找CSBV交尾传播的间接证据,利用RT-PCR方法对云南省蒙自市东村的3个中蜂群雄蜂精液及工蜂样本的CSBV进行检测。结果显示,3个蜂群的工蜂均被检测出携带CSBV,相对应的本... 为了解同群中蜂雄蜂精液及工蜂中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的感染情况,寻找CSBV交尾传播的间接证据,利用RT-PCR方法对云南省蒙自市东村的3个中蜂群雄蜂精液及工蜂样本的CSBV进行检测。结果显示,3个蜂群的工蜂均被检测出携带CSBV,相对应的本群雄蜂精液样本也被检测出携带CSBV,二者呈正相关关系,雄蜂精液样本的平均感染率达到93.33%。结果表明,雄蜂精液是CSBV的携带者,为CSBV的交尾传播提供了间接证据。 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病毒 雄蜂 精液 工蜂 RT—PCR
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中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP_2结构蛋白的基因分析及B细胞抗原表位预测 被引量:3
9
作者 张琳 钱爱东 毛靖宇 《辽宁医学院学报》 CAS 2012年第5期407-410,436,I0003,I0004,共7页
目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP2蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法将已感染CSBV LN-QY株的RNA作为模板,进行RT-PCR扩增该毒株结构蛋白VP2基因,再与pMD18-T载体连接,之后转化大肠杆菌DH5α感受态... 目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP2蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法将已感染CSBV LN-QY株的RNA作为模板,进行RT-PCR扩增该毒株结构蛋白VP2基因,再与pMD18-T载体连接,之后转化大肠杆菌DH5α感受态,对经EcoRⅠ和BamH I双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP2的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP2结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP2结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于178-184,144-199,211-217氨基酸区段。结论本研究为CSBV LN-QY株VP2蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础。 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病毒 VP2结构蛋白 空间结构 B细胞表位 预测
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中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立 被引量:15
10
作者 马鸣潇 李明 +4 位作者 袁春颖 李鹏飞 张轶博 苏玉虹 曲祖乙 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第4期425-427,共3页
目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的... 目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测。结果所建立的CSBVRT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,最低可检出10pgDNA。临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带。结论已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病毒 反转录聚合酶链式反应 特异性 敏感性
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中蜂囊状幼虫病毒RdRp基因dsRNA干扰的研究 被引量:10
11
作者 史红霞 党晓群 +5 位作者 朱祥龙 马振刚 刘永梅 黄钰彬 周泽扬 许金山 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期103-111,共9页
中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)可以引起中蜂幼虫死亡,给中蜂的养殖造成严重的威胁。其RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)是病毒复制中必不可少的中心酶,控制着病毒的复制和翻译过程。本研究以CSB... 中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)可以引起中蜂幼虫死亡,给中蜂的养殖造成严重的威胁。其RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)是病毒复制中必不可少的中心酶,控制着病毒的复制和翻译过程。本研究以CSBV RdRp基因为靶标,选取两个干扰区域RdRp-1和RdRp-2,并构建相应的dsRNA表达载体,获取dsRNA后进行RNAi实验,通过qRT-PCR检测CSBV RdRp基因的表达情况。实验结果显示:干扰片段RdRp-1不能显著下调RdRp基因的转录,而干扰片段RdRp-2可显著性下调RdRp表达并具有剂量依赖性,当添食2μg dsRdRp-2时,在72 h RdRp基因表达下调了85%,CSBV的衣壳蛋白VP1基因下调表达78%,幼虫死亡率降低60%,表明RdRp基因可以作为RNA干扰的靶标用于CSBV防治,本研究为后期在养蜂场进行蜜蜂病毒病的防治奠定了基础。 展开更多
关键词 中华蜜蜂 中蜂囊状幼虫病毒(csbv) RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp) dsRNA的体外表达 RNAI
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中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP1蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测 被引量:5
12
作者 程健 张佩 +2 位作者 马鸣潇 李明 杨松 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第3期280-284,共5页
目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoRⅠ和HindⅢ双酶... 目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP1的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP1结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段。结论本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础。 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病毒 病毒结构蛋白质类 空间结构 表位 B淋巴细胞 预测
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中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP3蛋白空间结构及其B细胞抗原表位的预测 被引量:2
13
作者 费东亮 毛靖宇 +1 位作者 宋英今 马鸣潇 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第9期1106-1111,共6页
目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法采用RT-PCR法从感染CSBV的蜜蜂幼虫总RNA中扩增结构蛋白VP3基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒,双酶... 目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法采用RT-PCR法从感染CSBV的蜜蜂幼虫总RNA中扩增结构蛋白VP3基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒,双酶切鉴定并测序,通过与SBV-KOR、CSBV-UK株VP3基因序列的比对,获得LN-QY株VP3基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列,建立VP3蛋白的3D结构。在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP3结构蛋白的空间构象较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于4个区域:25-50,101-109,112-120,250-268氨基酸区段,其中,可能出现抗原表位的2个区域在100-150和250-300氨基酸区段,应作为抗原表位研究的重点区域。结论预测了CSBV LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位,为CSBVVP3蛋白单克隆抗体的制备以及表位疫苗的设计奠定了理论基础。 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病毒 VP3结构蛋白 空间结构 B细胞抗原表位 预测
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中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2杆状病毒表达与间接ELISA方法建立
14
作者 李明 张琳 +1 位作者 马鸣潇 侯振中 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期264-269,共6页
为了检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)抗体水平,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建含有CSBV VP2的重组杆状病毒rBac-VP2,并在昆虫细胞中获得表达。用经过纯化的重组VP2蛋白作为包被抗原,建立CSBV抗体的间接酶联... 为了检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)抗体水平,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建含有CSBV VP2的重组杆状病毒rBac-VP2,并在昆虫细胞中获得表达。用经过纯化的重组VP2蛋白作为包被抗原,建立CSBV抗体的间接酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法。结果表明成功的表达了VP2蛋白。优化反应条件后,建立的ELISA检测方法仅与CSBV阳性IgY发生特异性反应,与其它蜜蜂病毒的阳性IgY不发生交叉反应,且检测阳性IgY的灵敏度达到了1∶6 400,证明其具有良好的特异性和敏感性。批内重复与批间重复变异系数均小于10%。与CSBV全病毒包被进行比较,检测结果差异不显著,说明该方法适用于抗CSBV抗体检测。 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病毒(csbv) 结构蛋白VP2 Bac‐to‐Bac杆状病毒表达 间接ELISA
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中蜂囊状幼虫病毒VP1基因的优化表达及其免疫原性分析 被引量:3
15
作者 张皓淳 宋立先 +4 位作者 万红霞 马鸣潇 曲祖乙 费东亮 钟义 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第5期468-474,共7页
目的原核表达优化的中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的VP1基因,并分析其免疫原性。方法根据大肠埃希菌密码子偏爱性对野生型CSBV VP1(wt VP1)基因进行优化(opti VP1),将基因wt VP1和opti VP1分别克隆至p GEX-6P-1原核表... 目的原核表达优化的中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的VP1基因,并分析其免疫原性。方法根据大肠埃希菌密码子偏爱性对野生型CSBV VP1(wt VP1)基因进行优化(opti VP1),将基因wt VP1和opti VP1分别克隆至p GEX-6P-1原核表达系统,构建原核表达质粒p GEX-6P-wt VP1和p GEX-6P-opti VP1,分别转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并对诱导温度、IPTG终浓度及诱导时间进行优化,诱导蛋白经Western blot鉴定;重组蛋白经GSH-琼脂糖凝胶层析纯化;分别用PBS、纯化的GST标签蛋白、纯化的重组蛋白及CSBV纯化病毒免疫小鼠,经间接ELISA法检验各组小鼠的血清抗体效价。结果优化后的VP1基因序列降低了密码子影响指数,提高了密码子适应指数;质粒p GEX-6P-wt VP1和p GEX-6P-opti VP1经鉴定证明构建正确;最佳诱导表达条件为:IPTG终浓度0.8 mmol/L,30℃,220 r/min诱导8 h;诱导表达蛋白占菌体总蛋白百分比由wt VP1菌株(5.49±0.30)%提高至opti VP1菌株(59.7±0.51)%,纯化后纯度可达0.5 mg/ml;兔抗GST标签抗体及兔抗CSBV血清均与优化后的重组蛋白发生特异性反应;重组蛋白组小鼠二免后可产生较高水平抗体,明显高于PBS组和GST标签蛋白组(P<0.05)。结论通过密码子优化实现了CSBV结构基因VP1的高效表达,表达蛋白可诱导小鼠机体产生特异性抗体,具有良好的免疫原性,为探讨CSBV感染的分子发病机制和制备抗CSBV病毒的多克隆抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病毒 VP1结构蛋白 原核表达 免疫原性
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中蜂囊状幼虫病病毒依赖解旋酶扩增检测方法的建立 被引量:4
16
作者 李勇飞 马鸣潇 +1 位作者 宋英今 李银平 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第2期267-271,共5页
目的建立中蜂囊状幼虫病病毒(chinese sacbrood,CSBV)依赖解旋酶扩增(helicase-dependent amplific ation,HDA)检测方法,并对该方法进行优化及验证。方法提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫RNA,以其为模板进行HDA,对建立的HDA的引物浓度(原始... 目的建立中蜂囊状幼虫病病毒(chinese sacbrood,CSBV)依赖解旋酶扩增(helicase-dependent amplific ation,HDA)检测方法,并对该方法进行优化及验证。方法提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫RNA,以其为模板进行HDA,对建立的HDA的引物浓度(原始浓度为50μmol/L,进行10、20、40、80、160、240、320倍稀释)、反应温度(60、65及70℃)及时间(60、90及120 min)进行优化,并对优化的方法进行特异性、敏感性及稳定性验证。经电镜观察、RT-PCR及优化的HDA法对37份临床样品进行检测。结果 HDA最佳引物浓度、反应温度及时间分别为5μmol/L、65℃及90 min;CSBV与健康幼虫、蜜蜂急性麻痹病毒(acute bee paralysis virus,ABPV)、蜜蜂慢性麻痹病毒(chronic bee paralysis virus,CBPV)、黑蜂王台病毒(black queen cell virus,BQCV)和残翅病毒(deformed wing virus,DWV)cDNA均无交叉反应,HDA的最低检出限为10-2ng,检测试剂保存12个月后,仍可扩增出目的条带;37份临床样品中,有6份样品的RT-PCR和HDA结果为阳性,但电镜观察仅有4份为阳性。结论建立了CSBV HDA检测方法,该方法具有较高的敏感性、特异性及稳定性,为检测其他蜂病毒及快速鉴定其他动物病毒提供了参考。 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病病毒 依赖解旋酶扩增
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RNAi靶向VP2基因抑制中蜂囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内复制研究 被引量:8
17
作者 马跃宇 费东亮 +3 位作者 郭亚茜 金宏凯 张溪研 马鸣潇 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期96-102,共7页
中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,R... 中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用和其对CSBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响,设计合成针对CSBV VP2基因的特异性siRNA,以100 nM的浓度与pEGFPN1-VP2-CSBV融合表达载体共同转染至293T细胞中,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析siRNA在体外对CSBV VP2基因表达的干扰效果。同时,将siRNA(1μg/μL)和1×10~7拷贝数的CSBV共同饲喂2日龄中华蜜蜂幼虫,检测幼虫体内CSBV拷贝数和幼虫存活率,研究siR-NA对中华蜜蜂幼虫体内CSBV复制的影响。荧光结果显示,在293T细胞中siRNA能抑制CSBV VP2蛋白的表达,并且通过流式细胞仪检测分析发现干扰效果接近40%。幼虫饲喂实验表明,饲喂siRNA组在各时间点幼虫体内CSBV拷贝数均低于CSBV对照组,且在摄入siRNA后感染CSBV的幼虫存活率明显上升,与CSBV组差异极显著(P<0.01)。通过本研究,证明了针对CSBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi,影响CSBV在中蜂体内的复制,为深入研究CSBV VP2基因的功能和研发抗CSBV生物制剂提供了理论基础。 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病毒(csbv) 结构蛋白基因VP2 RNA干扰 病毒复制
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中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2的密码子优化表达及其免疫原性研究 被引量:5
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作者 李芳兵 费东亮 +6 位作者 张皓淳 胡影 魏东 张鹤 岳金金 马鸣潇 曲祖乙 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期231-237,共7页
利用生物信息学软件对编码中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)VP2结构蛋白的密码子进行优化来提高VP2蛋白表达量,并进行免疫原性研究确定VP2蛋白的免疫原性。通过对17株囊状幼虫病毒(SBV)和7株中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的VP2... 利用生物信息学软件对编码中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)VP2结构蛋白的密码子进行优化来提高VP2蛋白表达量,并进行免疫原性研究确定VP2蛋白的免疫原性。通过对17株囊状幼虫病毒(SBV)和7株中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的VP2基因序列进行比对,选取代表毒株(GenBank:HM237361.1)CSBV-LN株VP2基因作为参考序列,并用在CSBV所有毒株中保守性相对较强的氨基酸替换CSBV-LN株VP2对应位置的氨基酸,通过在线软件(http://www.jcat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)对其密码子进行优化,构建原核表达质粒pET-28a-optiVP2,并转化入BL21(DE3)中,进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westren blot鉴定正确后,将表达蛋白纯化并免疫至白来杭母鸡,对免疫鸡的抗体水平和淋巴细胞增值指数进行检测,研究CSBV VP2蛋白的免疫原性。同时,收集免疫后鸡蛋制备卵黄抗体,经纯化再与CSBV相互作用后,接种于3日龄蜜蜂幼虫,观察接种后幼虫死亡率,研究卵黄抗体中和CSBV病毒能力。结果显示,优化后的optiVP2能够在大肠杆菌中高效表达,其表达产物具有良好免疫原性,表达产物接种白来杭母鸡可诱导产生抗体,制备的卵黄抗体具有中和CSBV的作用。本实验实现了CSBV结构基因VP2在原核系统的高效表达,鸡免疫实验表明其具有良好免疫原性,并且可诱导鸡产生保护作用中和抗体,为进一步开发防治CSBV的生物制剂提供了帮助。 展开更多
关键词 中蜂囊状幼虫病毒(csbv) VP2基因 系统进化 密码子优化 原核表达
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中华蜜蜂囊状幼虫病病毒单克隆抗体的制备与鉴定 被引量:1
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作者 张鹤 李明 +4 位作者 孙莉 费东亮 岳金金 金宏凯 马鸣潇 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期914-919,共6页
为了制备中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)单克隆抗体,本实验利用纯化的中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)免疫Balb/c小鼠,经过3次免疫后,小鼠断尾采血测其血清效价,选择效价高于1∶80 000的小鼠,在细胞融合前3~4d再加强免疫一次。取免疫小鼠脾... 为了制备中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)单克隆抗体,本实验利用纯化的中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)免疫Balb/c小鼠,经过3次免疫后,小鼠断尾采血测其血清效价,选择效价高于1∶80 000的小鼠,在细胞融合前3~4d再加强免疫一次。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后注射入Balb/c小鼠(Mus musculus)腹腔制备单抗腹水。共获得9株稳定分泌抗CSBV的单克隆抗体,命名为10A1、5B10、5A5、5H2、11D7、9A5、1D3、3C10、10C4,效价都在1∶16 000以上,经间接ELISA实验检测表明,具有较好的特异性。在此基础上,将9株腹水单抗分别与CSBV互作后,接种于2~3日龄中华蜜蜂幼虫,观察幼虫死亡率,研究单克隆抗体中和CSBV病毒能力,结果表明筛选到三株单克隆抗体(10A1、5A5、9A5)对CSBV有中和作用,为CSBV的防治研究奠定了基础。 展开更多
关键词 中华蜜蜂囊状幼虫病毒(csbv) 杂交瘤细胞 单克隆抗体(McAb)
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