Plk1、Chk1/2在原发性肝癌组织及HepG2细胞中的表达研究

目的:研究保罗样激酶1(Polo-like kinase1,Plk1)、细胞周期检测点激酶1、2(Checkpoint kinase 1/2,Chk1/2)在原发性肝癌组织与人肝癌细胞Hep G2中的表达情况。方法:使用免疫组织化学Envision法检测40例原发性肝癌组织及16例肝非肿瘤组织中Plk1、Chk1/2蛋白的表达。提取培养后的Hep G2细胞蛋白。利用蛋白免疫印记(Western blot)技术定性分析Plk1、Chk1/2蛋白在Hep G2细胞中的表达情况,并测定灰度值进行定量分析。结果:原发性肝癌组织中Plk1、Chk1蛋白的阳性表达率分别是57.5%、75%,高于它们在肝非瘤组织中的表达率0%、25.0%(P<0.05)。Chk2在原发性肝癌组织中的表达阳性率22.5%,低于肝非肿瘤组织中的表达率56.3%(P<0.05)。Plk1、Chk1/2蛋白在Hep G2细胞中均有表达。其相对表达量分别是:0.39±0.022 6、0.08±0.024 9、0.01±0.006 6,三者之间的差异均有统计学意义,其表达的顺序依次为Plk1>Chk1>Chk2。结论:Plk1、Chk1蛋白在原发性肝癌组织中表达上调,而Chk2蛋白在原发性肝癌组织中表达下调。Plk1、Chk1/2基因作为细胞周期调控中的重要激酶在Hep G2细胞中均有表达,其表达顺序为Plk1>Chk1>Chk2。Plk1、Chk1具有相对意义的肿瘤选择性表达,可能成为肝癌生物治疗中新的治疗靶点。

Chk1/2反义寡核苷酸对顺铂诱导的A549细胞生物学行为的影响

目的观察顺铂作用下A549细胞的细胞周期变化规律和Chk1、Chk2(Chk1/2)反义寡核苷酸(AsODN)对顺铂(DDP)诱导的A549细胞生物学行为的影响。方法流式细胞术SubG1法检测DDP作用下A549细胞周期和凋亡的动力学变化;蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测转染Chk1/2AsODN后Chk1/2蛋白的表达;流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC法和SubG1法检测转染Chk1/2AsODN后DDP作用下的细胞周期和凋亡变化。结果10μmol/LDDP作用12h后A549细胞出现明显的S期阻滞,Chk1/2AsODN对A549细胞中Chk1/2蛋白表达有明显抑制作用,转染Chk1/2AsODN可显著增加DDP诱导下A549细胞的凋亡率约200%～300%,而联合转染Chk1/2AsODN与单转染相比,凋亡无明显增加(P>0.05)。转染Chk1/2AsODN引起化疗增敏的机制是通过解除S期阻滞这种肿瘤细胞的自我保护机制实现的。结论Chk1/2可作为肺癌化疗药物增敏治疗的有效靶点,灭活Chk1/2基因可以显著增强肿瘤细胞化疗的敏感性。

DADS对Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞G_2/M期的影响

目的在建立Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞基础上,探讨DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞G_2/M期的作用。方法分别采用集落形成实验、流式细胞术、RTPCR、Western blot等方法,检测DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞增殖、细胞周期分布、Chk1与Chk2 mRNA与蛋白、p-Chk1与p-Chk2及CDC25C与cyclinB1的表达。结果软琼脂集落形成实验显示,30 mg·L^(-1)DADS作用Chk1与Chk2高表达MGC803细胞组集落形成率均明显低于对照组与空载体组(P<0.05)。流式细胞术显示,30 mg·L^(-1)DADS作用12、24、36、48 h后,Chk1/MGC803细胞G_2/M期分别为41.3%、57.4%、68.9%、42.9%,较MGC803细胞与Chk2/MGC803细胞明显增加(P<0.05)。而Chk2/MGC803细胞与MGC803细胞差异没有显著性(P>0.05)。RT-PCR显示,Chk1/MGC803与Chk2/MGC803细胞Chk1与Chk2mRNA水平较对照组无明显变化;并且,Western blot显示,Chk1与Chk2总蛋白及p-Chk2的表达无明显改变,但pChk1呈时间依赖性上调,CDC25C与cyclinB1呈时间依赖性下调(P<0.05)。结论 DADS可阻滞Chk1/MGC803细胞于G_2/M期,与上调磷酸化Chk1和下调CDC25C与cyclinB1有关。

Chk1/2转基因MGC803细胞系的建立与鉴定

目的构建Chk1/2基因的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌MGC803细胞,为研究Chk1/2功能奠定基础。方法参照野生型Chk1/2基因mRNA全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序法对重组质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染入MGC803细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot检测表达产物。结果菌液特异性PCR结果表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,测序分别证实为Chk1和Chk2基因,经NCBIBLAST分析与Genbank中Chk1基因的同源性为100%,编码的氨基酸同源性为100%,Chk2基因的同源性为99%,编码的氨基酸同源性为100%。G418筛选转染细胞4周后获得稳定转染空载体pcD-NA3.1(+)的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的MGC803细胞。经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在MGC803细胞中的表达比对照组明显增加。结论成功构建Chk1/2基因真核表达载体与Chk1/2高表达MGC803细胞,为研究二烯丙基二硫诱导MGC803细胞G2/M期阻滞的机制奠定了基础。

Chk1和Chk2高表达人胃癌BGC823细胞的建立与鉴定

细胞周期检测点Chkl和Chk2在参与G2/M期起着重要作用,本研究构建Chk1/2的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌BGC823细胞,进一步证明Chk1/2高表达对BGC823细胞G2/M期的影响。根据NCBI Gen Bank Chk1/2基因全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点。从人胃癌细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序对重组质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染BGC823细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot检测表达产物。结果显示,菌落特异性PCR表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,经测序与NCBIBLAST分析证实为Chk1和Chk2基因。稳定转染空载体pcDNA3.1的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的BGC823细胞,经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在BGC823细胞中的表达较对照组与空载体组明显增加(P<0.05)。流式细胞术检测显示,Chk1转染组G2/M细胞较对照组与空载体组明显增加(P<0.05),而Chk2转染组G2/M细胞无明显差异(P>0.05)。上述结果表明,成功构建pcDNA3.1/Chk1与pcDNA3.1/Chk2真核表达载体和Chk1与Chk2高表达的BGC823细胞,Chk1高表达可阻滞BGC823细胞于G2/M。

Chk1与Chk2高表达对DADS阻滞人胃癌BGC823细胞G2/M期的影响

目的:在建立Chk1/2基因高表达人胃癌BGC823细胞的基础上,探讨Chk1/2基因在二烯丙基二硫(DADS)诱导人胃癌BGC823细胞G2/M期阻滞中的作用。方法:采用流式细胞术检测DADS作用于Chk1/2高表达BGC823细胞周期分布情况。Western blot检测Chk1、p-Chk1、Chk2、p-Chk2、Cdc25C与Cyclin B1表达变化。结果:流式细胞术显示,Chk1高表达组G2/M期细胞较对照组与空载体组增加(P<0.05)。而15 mg·L^(-1) DADS处理后,各组G2/M期细胞较处理前增加,Chk1高表达组较空载体组差异有统计学意义(P<0.05)。Chk2高表达组G2/M期细胞较对照组与空载体组差异无统计学意义(P>0.05)。而DADS处理Chk2高表达组后,G2/M期细胞较对照组与空载体组差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot显示,Chk1/2蛋白及p-Chk2表达水平不受DADS的影响,但p-Chk1呈时间依赖性上调(P<0.05)。DADS处理Chk1高表达BGC823细胞12、24、36、48 h后,Cdc25C磷酸酶与Cyclin B1表达较对照组呈时间依赖性下降(P<0.05)。结论:DADS阻滞人胃癌BGC823细胞G2/M期与激活Chk1/Cdc25C/Cyclin B1通路有关。Chk1高表达可增强DADS阻滞G2/M期细胞的作用,而Chk2高表达对DADS无影响。

Chk1和Chk2蛋白在大鼠睾丸发育过程中的表达与定位

目的检测细胞周期检测点激酶1(Checkpoint kinase 1,Chk1)和细胞周期检测点激酶2(Checkpoint kinase 2,Chk2)蛋白在大鼠睾丸不同发育阶段的表达与定位,探讨2种蛋白在大鼠精子发生过程中的功能。方法选择4日龄、28日龄、56日龄、84日龄的大鼠睾丸和附睾组织为实验材料,采用免疫组化方法检测Chk1和Chk2蛋白在大鼠睾丸中的表达与定位。结果在精原细胞中,Chk1和Chk2都仅有微弱的表达; Chk2在细线期初级精母细胞中出现了强表达,而在粗线期初级精母细胞、早期精子细胞中未见表达,但在晚期精子细胞中再次出现强表达; Chk1蛋白在细线期初级精母细胞中未见表达,而在粗线期初级精母细胞中出现强表达,在早期精子细胞中表达不明显,在晚期精子细胞中出现强表达。Chk1在Leydig细胞中始终保持较强的表达,Chk2则是大鼠进入成年期后在Leydig细胞中表达出现增强。Chk1和Chk2在Sertoli细胞中始终维持微弱表达或不表达。结论通过对不同发育阶段大鼠睾丸细胞上Chk1和Chk2的表达与定位的研究发现,Chk1和Chk2可能分别在精子发生的不同阶段参于精子发育的调节,并共同在精子发生过程中发挥作用。

二烯丙基二硫通过磷酸化Chk1负调控Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路阻滞白血病K562细胞G_(2)/M期

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病K562细胞周期阻滞及其分子机制。方法:采用CCK-8、细胞计数及流式细胞术观察DADS对K562细胞增殖与周期阻滞效应。Western Blot检测DADS对K562细胞PCNA、Chk1/2以及下游分子Cdc25C、CyclinB1与CDK1表达的影响。结果:CCK-8检测显示,15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L DADS处理后,呈浓度依赖性抑制K562细胞增殖,抑制率分别为32.48%、59.34%、66.42%、77.06%、81.05%(P<0.05)。对照组与Tween80组无抑制作用(P>0.05)。细胞计数结果显示,30μmol/L、60μmol/L与120μmol/L DADS处理K562细胞后,群体倍增时间分别为22.71±0.29、36.69±0.93与73.02±0.87呈浓度依赖性增加(P<0.05),而Tween80组与对照组无明显差异(P>0.05)。流式细胞术检测显示,60μmol/L与120μmol/L DADS作用K562细胞24 h与48 h后,G_(2)/M期百分率分别增加到17.6%与28.5%和18.6%与34.4%,较对照组有显著性差异(P<0.05)。60μmol/L DADS作用K562细胞1 h、2 h、4 h、8 h和24 h后,PCNA表达呈时间依赖性表达下调(P<0.05)。p-Chk1表达呈时间依赖性上调(P<0.05),而Chk1、Chk2与p-Chk2表达无明显差异(P>0.05)。并且,Cdc25C、CyclinB1和CDK1分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但是,14-3-3蛋白无明显改变(P>0.05)。结论:DADS可磷酸化Chk1通过Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路抑制K562细胞增殖与阻滞G_(2)/M期。

电离辐射诱导G_2期阻滞的机制

电离辐射损伤后,细胞通过若干关卡来调控细胞周期的进程,使细胞有时间进行DNA修复,确保染色体组的完整性和遗传稳定性,减少突变的发生。不同的电离辐射使不同细胞产生G1、G2和S期等不同时相的变化,但电离辐射后G2期阻滞的现象十分普遍。近年来,对G2期阻滞机制的研究多集中在Chk1、Chk2和p53上。

灭活Chk1／2基因增强H4细胞放疗后凋亡敏感性

目的观察反义封闭Chk1和／或Chk2基因，阻断细胞周期检测点信号传导通路对胶质瘤H4细胞放疗后细胞周期和凋亡的影响，评价Chkl和Chk2基因作为肿瘤治疗靶点的有效性。方法流式细胞仪检测不同剂量^60Co照射引起的H4细胞周期和凋亡的动力学特点，以建立G2／M期细胞周期阻滞模型；Western blot法检测转染Chk1和Chk2正、反义寡核苷酸后，细胞内Chk1和Chk2蛋白表达；Annexin V—PI法检测单转染或联合转染Chk1／2反义寡核苷酸对放疗后H4细胞凋亡的影响。结果不同剂量的^60Co照射可引起H4细胞G2／M期阻滞，以10Gy^60Co照射12h G2／M期阻滞最明显；单独反义封闭Chk1或Chk2基因可增强放疗后凋亡敏感性100％-200％，而同时反义封闭Chk1和Chk2基因具有协同作用，增强放疗后凋亡敏感性300％，其机制是通过解除G2／M期阻滞实现的。结论放疗可激活细胞周期检测点信号传导通路导致放疗抵抗，而阻断该信号通路的关键激酶Chk1和Chk2可显著增强放疗后凋亡敏感性。

chk1、chk2反义寡核苷酸转染HL-60细胞株增加其放疗后凋亡敏感性

目的 通过反义封闭chk1、chk2基因 ,阻断细胞周期检测点信号传导通路 ,从而增加HL 6 0细胞放疗敏感性。方法 对HL 6 0细胞进行chk1、chk2正义链和反义链的单转染与共转染 ,于转染后 2 4h进行放射线照射 ,照射后 2 4h用Westernblot测量chk1蛋白的变化 ,用流式细胞仪测定细胞周期及细胞凋亡率。结果 反义封闭chk1可增加HL 6 0细胞放疗后凋亡敏感性 ,细胞凋亡率为 2 6 .31%,明显高于正义链的 10 .34%,二者比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。转染chk1反义链的HL 6 0细胞G2 /M期阻滞现象减弱 ,G2 /M期细胞为 38.42 %,转染chk1正义链为 5 4.6 4%,二者比较差异有显著性 (P <0 0 1)。联合反义封闭chk1、chk2具有协同增效作用。结论 反义封闭chk1、chk2基因可增加HL 6 0细胞放疗后凋亡敏感性。

灭活细胞周期检测点激酶增强乳腺癌细胞放疗敏感性

目的:乳腺癌是严重威胁妇女健康的重要疾病,放疗常常作为乳腺癌综合治疗的重要手段。研究表明,临床上产生放疗抵抗的主要原因是由于放疗激活细胞周期检测点信号传导通路引起细胞自我修复而逃避凋亡,因而目前通过抑制细胞周期检测点信号通路增强肿瘤放、化疗敏感性,已成为国际上抗肿瘤治疗的一个重要方向和研究热点。Chk1和Chk2是细胞周期检测点中最重要的丝氨酸/苏氨酸激酶,本研究通过反义封闭Chk1和/或Chk2基因,阻断细胞周期检测点信号传导通路,研究对乳腺癌MDA-MB-231细胞放疗后细胞周期和凋亡的影响,从而评价Chk1和Chk2基因作为肿瘤治疗靶点的有效性。方法:Western-Blot法检测转染Chk1和Chk2正、反义寡核苷酸后,细胞内Chk1和Chk2蛋白表达情况;流式细胞仪AnnexinV-PI法和SubG1法检测单转染或联合转染Chk1/2反义寡核苷酸对放疗后MDA-MB-231细胞凋亡和细胞周期的影响。结果:反义封闭Chk1或Chk2基因可解除G2/M期阻滞,增强放疗后凋亡敏感性,而同时反义封闭Chk1和Chk2基因具有协同作用。结论:阻断细胞周期检测点信号通路的关键激酶Chk1和Chk2可显著增强放疗后凋亡敏感性。