RNA干扰Chk1/2调控二烯丙基二硫诱导的G2/M期阻滞作用及相关周期蛋白表达

在细胞周期检测点信号传导通路中,Chkl和Chk2起着重要作用,主要参与G2/M期细胞周期检测点信号传导.首先采用RNAi技术在BGC823细胞中将Chk1、Chk2基因沉默,Chk1、Chk2 siRNA转染BGC823细胞后24h加入15mg/L二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS),接着通过Real-timePCR、Western blot分析Chk1、Chk2基因在转染前后的表达差异,然后运用流式细胞术和Western blot分析Chk1、Chk2基因沉默后对DADS诱导的细胞周期G2/M期阻滞作用及相关周期蛋白CDC25C和cyclinB1表达的影响.实验结果表明,与未转染对照组相比,转染Chk1、Chk2siRNA后BGC823细胞中Chk1、Chk2表达明显被抑制,二者的mRNA表达分别下降84.7%和69.0%,蛋白质水平分别下降73.4%和78.5%.流式细胞术分析结果发现,ChklsiRNA转染的BGC823细胞在15mg/LDADS处理24h后,G2/M期比例由单纯DADS处理组的58.1%降至10.4%(P<0.05).但Chk2 siRNA转染后加入15mg/LDADS,与单独15mg/LDADS作用相比,细胞周期G2/M期比例差异不明显(P>0.05).Chk1和Chk2下游分子的改变显示,DADS可抑制BGC823细胞中CDC25C和cyclinB1表达(P<0.05),但Chk1基因沉默后加入DADS,CDC25C和cyclinB1表达却不被抑制(P>0.05),Chk2基因沉默后对DADS抑制CDC25C和cyclinB1表达的作用无影响.由此得出结论,Chkl基因沉默可消除DADS诱导BGC823细胞G2/M期阻滞作用,DADS阻滞G2/M期可能是通过Chk1/CDC25C/cyclinB1信号通路起作用.

DADS通过Chk1/Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路诱导白血病HL-60细胞G2/M期阻滞

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病HL-60细胞周期阻滞及其分子机制。方法采用细胞计数、软琼脂克隆形成实验及流式细胞术观察DADS对HL-60细胞生长抑制与周期阻滞效应。Western blot检测DADS对HL-60细胞Chk1/2以及下游分子的影响。结果细胞计数显示,60、120μmol·L-1DADS处理后,其群体倍增时间从19.14 h增加到35.03、71.82 h(P<0.05)。软琼脂克隆形成实验表明,30、60、90、120μmol·L-1DADS对HL-60细胞克隆形成率的抑制率分别为35.06%、62.10%、93.79%、99.35%(P<0.05)。流式细胞术检测显示,60和120μmol·L-1DADS分别作用HL-60细胞24 h后,DADS可呈时间与浓度依赖性诱导HL-60细胞G2/M期阻滞(P<0.05)。60μmol·L-1DADS处理HL-60细胞后,p-Chk1可呈时间依赖性上调(P<0.05),而Chk1与Chk2总蛋白和pChk2无改变(P>0.05)。并且,Cdc25C、CyclinB 1和CDK1分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但14-3-3蛋白表达没有改变(P>0.05)。结论 DADS能够抑制HL-60细胞增殖,并通过Chk1/Cdc25C/CyclinB 1/CDK1通路阻滞HL-60细胞于G2/M期。

沉默Chk1基因对DADS阻滞人胃癌BGC823细胞G2/M期的影响

目的:探讨沉默Chk1基因在二烯丙基二硫(DADS)诱导人胃癌BGC823细胞G2/M期阻滞中的作用。方法:采用RNAi技术沉默BGC823细胞Chk1基因,q-PCR与Western blot检测Chk1 mRNA与蛋白表达。流式细胞术检测DADS作用与Chk1基因沉默BGC823细胞周期分布情况。Western blot检测Cdc25C与cyclin B1表达。结果:流式细胞术显示,15 mg·L-1DADS作用BGC823细胞12、24、36、48 h后,G2/M期细胞呈时间依赖性增加(P<0.05)。Chk1沉默BGC823细胞Chk1 mRNA与蛋白表达下调(P<0.05)。沉默Chk1后,G2/M期细胞较对照组降低(P<0.05)。DADS处理后,对照组G2/M细胞高于Chk1沉默组(P<0.05)。Chk1基因沉默后Cdc25C和Cyclin B1表达较对照组增加(P<0.05)。DADS处理对照组后,Cdc25 C和Cyclin B1表达较未处理组降低(P<0.05)。DADS处理Chk1沉默组Cdc25 C和Cyclin B1表达较Chk1沉默下调(P<0.05)。结论:Chk1沉默可通过促进Cdc25C和Cyclin B1表达减弱DADS阻滞G2/M的作用,DADS阻滞G2/M的检查点是Chk1。

AA12(LG21)可溶性表达研究及抗体制备

用PCR技术从AA12基因上扩增出LG21(100～498bp)片段,并克隆到原核表达载体pET-28a(+)上;转化大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达研究,使其在大肠杆菌中能够可溶性表达,优化表达条件获得表达量比较高的LG21蛋白;用镍离子螯和柱(Ni-NTA)纯化LG21蛋白,获得纯度较高的蛋白。用纯蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA结果显示效价可达到1∶163840;Western结果表明该抗体可以与LG21蛋白特异结合;为进行免疫共沉淀实验,验证Chk1蛋白与AA12蛋白在体内的相互作用奠定了基础。

二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞G2／M期检查点Chk1与Chk2的影响

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞G2/M期检查点Chk1与Chk2的影响。方法流式细胞术检测细胞周期改变;Northern blot、Westernblot与免疫细胞化学检测DADS处理MGC803细胞的Chk1与Chk2表达。结果流式细胞术分析显示,30 mg.L-1DADS呈时间依赖性阻滞MGC803细胞在G2/M期(P<0.05);Northern blot检测表明,DADS不同时间作用MGC803细胞后,Chk1与Chk2 mRNA表达与未处理组差异无显著性(P>0.05);免疫细胞化学发现Chk1与Chk2表达与未处理组无明显改变(P>0.05);Western blot DADS在不同时间对MGC803细胞Chk1与Chk2总蛋白表达无改变(P>0.05),而磷酸化的Chk1表达呈时间依赖性增加(P<0.05),但磷酸化的Chk2无明显改变(P>0.05)。结论 DADS阻滞MGC803细胞G2/M期与磷酸化Chk1有关。

Ch1/2对肿瘤细胞凋亡的调节作用

目的:观察顺铂作用下K562细胞及白血病骨髓单个核细胞(BMMNC)的细胞周期变化和转染Chk1／2反义寡核 苷酸对顺铂诱导下K562细胞及白血病BMMNC凋亡的影响。方法:用流式细胞仪检测顺铂作用下。K562细胞及白血病 BMMNC的细胞周期变化。转染Chk1和Chk2反义寡核苷酸于K562细胞及白血病BMMNC,检测顺铂作用下转染细胞的凋亡 率。结果:10μmol／L顺铂作用下K562细胞和白血病BMMNC均出现S期阻滞,转染Chk1／2反义寡核苷酸可明显增加顺铂 诱导下K562细胞凋亡,转染Chk1反义寡核苷酸可明显增加顺铂诱导下白血病BMMNC的凋亡率,但转染Chk2反义寡核苷酸 未增加白血病BMMNC的凋亡率。结论:Chk1在肿瘤细胞凋亡中有重要调节作用,可作为肿瘤增敏治疗的有效靶点,Chk2在 肿瘤细胞凋亡中的作用需进一步研究。

Chk1／2基因表达对精子浓度和活力的影响

目的:研究精子中细胞周期检测点激酶1/2(Chk1和Chk2)基因的表达对精子浓度及活力的影响。方法:将精液样本根据精子浓度和活力(前向运动精子百分率)分为正常对照组、少精子症组、弱精子症组和少弱精子症组,每组20例。分别检测各组精子DNA碎片指数(DFI)、精子存活率,采用RT-PCR和Western印迹方法分别检测各组精子Chk1、Chk2的表达。结果:①4组DFI分别为21.24±6.93、19.67±7.64、21.52±6.92、19.28±11.55,无显著差异(P>0.05);4组精子存活率分别为(83.48±9.87)%、(63.86±9.16)%、(50.45±16.99)%、(39.21±15.74%),与正常对照组相比,其余3组均有显著下降(P均<0.05);②DFI>30%和DFI≤30%两组精子的浓度、活力和精子存活率之间的差异有统计学意义(P<0.01);③ RT-PCR检测结果显示,4组Chk1 mRNA相对表达量分别为0.73±0.22、0.62±0.14、1.03±0.39、0.92±0.071,各组间比较差异有显著性(P<0.01),其与精子浓度呈正相关(b=80.661,P<0.01),与精子活力呈负相关(b=-19.275,P<0.01);4组Chk2mRNA相对表达量分别为0.66±0.30、0.27±0.09、0.59±0.19、0.42±0.11,各组间比较差异有显著性(P<0.01),其与精子浓度呈负相关(b=-90.809,P<0.01),与精子活力呈正相关(b=27.507,P<0.01)。④Western印迹结果显示,4组Chk1蛋白相对表达量分别为0.63±0.05、0.42±0.03、1.13±0.08、0.87±0.07,各组间比较差异有显著性(P<0.01),其与精子浓度呈正相关(b=55.74,P<0.01),与精子活力呈负相关(b=-22.649,P<0.01);4组Chk2蛋白相对表达量分别为1.23±0.36、0.37±0.16、0.87±0.08、0.68±0.12,各组间比较差异有显著性(P<0.01),其与精子浓度呈负相关(b=-53.001,P<0.01),与精子活力呈正相关(b=16.676,P<0.01)。结论:Chk1和Chk2在人类精子中均有显著表达,在精子DNA出现损伤后,Chk1表达的增强可能促进了精子的凋亡导致弱精子症,而Chk2表达的增强则可能抑制了精子的生成而导致少精子症。

Chk1基因沉默对人卵巢癌细胞A2780放疗敏感性的影响

目的探讨Chk1基因沉默对人卵巢癌细胞A2780放疗敏感性的影响。方法构建Chk1基因的短发夹RNA(shRNA)质粒转染人卵巢癌细胞A2780,同时以转染空载体和未转染组作为对照组,运用RT-PCR、蛋白免疫印迹方法观察转染前后Chk1基因表达的差异;四甲基偶氮唑蓝试验绘制细胞生长曲线;克隆形成试验观察细胞的放射敏感性变化。结果与对照组相比,构建shRNA表达载体可抑制人卵巢癌细胞A2780中Chk1 mRNA转录和蛋白的表达;Chk1基因沉默后细胞生长明显慢于对照组;并通过解除G2/M期阻滞,显著提高肿瘤细胞对放射线的敏感性。结论靶向Chk1的shRNA能有效抑制人卵巢癌细胞A2780的Chk1基因表达,促进细胞凋亡,增强肿瘤对放疗的敏感性。

chk1反义寡核苷酸增加HeLa细胞顺铂作用下凋亡敏感性

目的:通过反义封闭chk1基因,阻断细胞周期检测点信号传导通路,从而增加宫颈癌HeLa细胞对顺铂(DDP)的敏感性.方法:采用MTT法检测梯度浓度DDP作用人宫颈癌细胞株HeLa24,48和72h后对细胞的生长抑制率.以脂质体为载体将chk1正义链和反义链转染HeLa细胞,用Western Blot测量Chk1蛋白的表达,用流式细胞仪和TUNEL法检测DDP作用后细胞凋亡率.结果:DDP对HeLa细胞有生长抑制作用,并有时间和浓度依赖性.反义封闭chk1基因可抑制Chk1蛋白表达(P<0.01),DDP作用下细胞凋亡率为54.1%,高于转染正义链的34.2%(P<0.01).结论:反义封闭chk1基因可增加HeLa细胞对DDP的凋亡敏感性.

细胞周期检测点激酶1/2基因与放疗敏感性关系

目的观察宫颈癌HeLa细胞chk1/2基因表达改变对X射线诱导凋亡的影响。方法以脂质体为载体将chk1/2正义链和反义链转染HeLa细胞,用Western blot检测HeLa细胞中chk1/2蛋白的表达,用流式细胞仪和TUNEL法检测X射线照射后细胞凋亡率。结果转染chk1/2反义寡核苷酸可明显抑制chk1/2蛋白表达(F=22.69,P<0.05),X射线作用下细胞凋亡率明显高于转染正义链组(F=23.65,P<0.05)。结论反义封闭chk1/2基因可增加HeLa细胞对X射线照射的凋亡敏感性。

散发性大肠腺瘤癌变过程中Rad51和Chk1的表达及意义

目的探讨Rad51和Chk1在散发性大肠腺瘤癌变中的表达及意义。方法采用免疫组化法检测71例大肠黏膜、66例散发性大肠腺瘤伴上皮不典型增生和98例大肠腺瘤癌变中,Rad51和Chk1的表达,并分析其与大肠癌临床病理特征的关系。结果①在大肠黏膜组、腺瘤组和癌变组中,Rad51和Chk1的表达水平逐渐升高。②在腺瘤癌变组中,Rad51的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05),Chk1的表达与肿瘤的分化程度有关。③在腺瘤组中,中重度不典型增生者Rad51和Chk1的阳性表达高于轻度不典型增生者。结论 Chk1和Rad51在大肠腺瘤癌变的发生、发展过程中起重要作用。

ATR-Chk1-Cdc25信号通路参与盘基网柄菌G2/M转变期的调控

显微镜观察盘基网柄菌野生型KAx--3细胞和突变型RNAi-allC细胞,计数结果表明后者的单细胞繁殖速度约为前者的8倍.为探究该突变型盘基网柄菌细胞周期缩短的原因,用荧光定量PCR和western blot研究了ATR-Chk1Cdc25信号通路在其中的可能作用.实验结果表明:RNAi-allC细胞中cdc25基因相对表达量约为KAx-3细胞的8倍,而其Chk1与ATR基因的相对表达量却明显低于KAx-3细胞.突变细胞中Cdc25蛋白含量高于KAx-3细胞,但其Chk1蛋白含量却显著低于KAx-3细胞.这些数据表明,两种类型细胞之间的ATR、Chk1、Cdc25在mRNA水平和蛋白表达上均存在差异,特别是ATR基因表达量的不同明显影响ChK1和Cdc25的表达量,提示ATR-Chk1-Cdc25信号通路应该在一定程度上参与了盘基网柄菌细胞周期G2/M期的调控.

一种新的抗辐射性相关蛋白AA12和CHK1相互作用研究

目的 :研究AA12蛋白与CHK1蛋白的相互作用。方法 :用在大肠杆菌中表达纯化的AA12 (LG2 1)蛋白制备多克隆抗体 ,Western印迹检测抗体的特异性 ;用自制的抗体在A1_5和B4细胞中进行了免疫共沉淀实验 ;同时将AA12与Chk1基因克隆入酵母双杂交载体中 ,将重组质粒导入酵母菌AH10 9中 ,检测报告基因的表达情况。结果 :Western印迹结果表明该抗体可以与AA12蛋白特异结合 ;并用免疫共沉淀实验验证了AA12蛋白与CHK1蛋白在哺乳动物细胞体内的相互作用。同时用酵母双杂交实验验证了AA12蛋白与CHK1蛋白在酵母体内的相互作用 ,β_半乳糖苷酶活性分析和α_半乳糖苷酶活性分析结果均为阳性。结论 :AA12蛋白和CHK1蛋白之间存在相互作用 ,此结果为进一步研究新基因AA12的功能奠定了基础。

人脑胶质瘤中ATM、ATR、Chk1和Chk2基因表达研究

目的研究ATM、ATR、Chk1和Chk2在人脑胶质瘤中的表达及其与肿瘤发生的关系。方法采用SYBR^TMGreen实时定量PCR技术检测35例人原发脑胶质瘤组织和10例正常脑组织中的ATM、ATR、Chk1和Chk2的表达水平。结果ART、Chk1和Chk2基因在各级脑胶质瘤中表达较正常脑组织升高，差异均有统计学意义（P〈0．05）。其中，ATR和Chk2基因表达在Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤组织之间差异均无统计学意义（P〉0．05），而Chk1在Ⅳ级胶质瘤中的表达较Ⅱ级、Ⅲ级胶质瘤明显升高，差异均有统计学意义（P〈0．05）。ATM基因表达量在正常脑组织和各级脑胶质瘤中差异无统计学意义（P〉0．05）。结论ATR、Chk1和Chk2在人脑胶质瘤中表达上调，说明这些基因可能与人脑胶质瘤的发生有关。其中，Chk1表达与肿瘤恶性程度有关，可作为判别胶质瘤病理级别的辅助指标。

依维莫司与顺铂协同损伤人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞机制的初步研究

目的探讨依维莫司与顺铂联合损伤人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞的分子机制。方法 依维莫司处理细胞后的信号通路实验分为对照组、50、100、200 nmol/L依维莫司处理组4组。依维莫司与顺铂联合处理的机制实验分为对照组、50 nmol/L依维莫司、25 μmol/L顺铂、50 nmol/L依维莫司 ＋ 25 μmol/L顺铂处理细胞组4组。通过Western印迹进行mTOR、Akt、DNA损伤相关信号以及Chk通路分析。结果 50、100、200 nmol/L依维莫司处理COLO-16细胞12、24 h后，mTOR 2448位点和2481位点的磷酸化水平降低，Rictor 1135位点磷酸化水平也降低。然而，下游信号ULK1蛋白的ser757位点的磷酸化水平、P70 S6激酶的thr389位点的磷酸化水平以及PKCα的thr638/641位点磷酸化水平的变化并不显著。依维莫司处理对Akt的总蛋白水平和磷酸化水平无明显影响。顺铂处理COLO-16细胞12、24 h后，Rictor的thr1135位点磷酸化水平和Chk1的ser345位点磷酸化水平明显升高，但依维莫司单独处理无类似效应。当依维莫司与顺铂联合处理后12和24 h，相对于顺铂单独处理的细胞，上调的Chk1和Rictor磷酸化水平受到明显抑制。结论 COLO-16细胞mTOR信号对依维莫司处理敏感，但其下游信号并非同步产生级联反应。依维莫司可能通过抑制检测点激酶1的激活增强顺铂诱导COLO-16细胞死亡，但无加重顺铂所导致的DNA损伤。