原油污染对栉孔扇贝抗氧化酶活性的影响

以原油水溶性成分(water soluble fraction of crude oil,WSF)为污染物,采用暴露实验法,研究了栉孔扇贝(Chlamys farreri)鳃和消化腺组织中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性的变化。结果表明,WSF污染下,鳃和消化腺组织SOD和CAT酶活性随暴露时间增加一般表现为降低-升高-降低的趋势,酶活性达到最高的时间随浓度不同而变化。第1天时消化腺SOD在0.08 mg/L浓度下被诱导,而后随时间增加表现为抑制效应;浓度为0.21和0.88 mg/L时消化腺SOD酶活性被抑制,随暴露时间延长而活性增加。暴露时间为4 d时,石油烃浓度在0.08和0.88 mg/L时鳃组织SOD酶活性均被抑制,而浓度为0.21 mg/L时被诱导。消化腺和鳃组织SOD可以作为扇贝被污染胁迫的指标。

栉孔扇贝NDPK基因的BAC-FISH定位研究

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北部沿海一个非常重要的养殖种类。核苷二磷酸激酶(NDPK)是一类广泛存在、高度保守,在细胞能量和信息传递中具有重要作用的酶。作者利用BAC-FISH技术将两个包含栉孔扇贝NDPK基因的BAC克隆定位到染色体同一位置上,该结果验证了物理图谱相关contig组装的可靠性,同时NDPK基因的染色体定位将对深入研究该基因的结构、功能以及应用于生产实践提供理论支撑。本研究结果将对栉孔扇贝染色体的深入研究以及染色体鉴别、图谱整合等工作提供重要参考。

不同贝龄栉孔扇贝数量性状的相关性和通径分析

为深入了解栉孔扇贝形态性状与湿重之间的关系,为栉孔扇贝选育工作中亲贝的挑选提供策略,本研究使用来自同一家系的栉孔扇贝子代324只一龄个体以及生长到二龄的230只个体的性状数据进行通径分析。性状数据包括壳长(x_1/cm),壳高(x_2/cm),壳宽(x_3/cm),湿重(y/g)。结果显示,所有形态性状和湿重之间的相关系数均达到极显著水平。其中与一龄贝湿重相关系数最大的是壳长,为0.939,与二龄贝湿重相关系数最大的是壳高,为0.808。通径分析结果显示,壳长对一龄贝湿重的直接影响最大(0.532),壳高对一龄贝湿重的直接影响最小(0.163)。壳高对二龄贝湿重的直接影响最大(0.451),壳长对二龄贝湿重的直接影响最小(0.191),决定系数与以上通径分析结果的变化趋势一致。利用多元回归的方法构建了一龄贝和二龄贝形态性状与湿重间的回归方程,一龄贝:y=–10.527+0.287x_1+0.087x_2+0.409x_3,R^2=0.926;二龄贝:y=–68.609+0.254x_1+0.719x_2+2.008x_3,R^2=0.830。本研究结果为栉孔扇贝种贝的挑选提供了理论依据。

微拟球藻的水产饵料效果研究

通过人工高密度培养微拟球藻（Nannochloropsis salina），对比研究了该藻作为直接饵料在栉孔扇贝（Chlamys farreri）育苗和间接饵料在牙鲆（Paralichthys olivaceus）育苗中的应用效果。结果表明，微拟球藻生长迅速、细胞颗粒小、富含EPA等不饱和脂肪酸、营养比较全面，同时具有较厚细胞壁的特点。通过不同的光生物反应器和高密度培养技术，可以比较容易地实现微拟球藻的高密度培养，藻液细胞密度维持在5～15亿个／mL的高密度水平，最高达到36亿／mL。藻体叶绿素和类胡萝卜素含量因培养条件不同而有差异，其中每个细胞内的叶绿素含量在8．60×10^-13g±0．65×10^-13g，类胡萝卜素含量在1．45×10^-13g±0．12×10^-13g。作为直接或间接饵料，微拟球藻在不同水产动物培育中的应用效果差异性很大。其中，微拟球藻作为饵料直接投喂栉孔扇贝幼虫，虽可被摄食但不容易消化，造成食物在栉孔扇贝幼苗胃内滞留盈胀，最后出现代谢性饥饿和营养不良现象进一步影响个体生长，该藻在栉孔扇贝幼虫培育中的饵料效果不很理想。相反，利用微拟球藻培育轮虫（Rotifer），然后再将后者投喂牙鲆仔鱼，作为间接饵料微拟球藻不仅大幅提高牙鲆的成活率，同时还明显增加牙鲆的生长速度，是培育仔稚鱼开口饵料轮虫的优质微藻。微拟球藻在不同水产动物育苗中应用效果明显差异的原因，主要在于该藻是否能够被充分消化吸收。因此，有效破碎微拟球藻细胞壁技术和提高消化吸收措施都将推动该藻在水产中的应用。

盐度突降对栉孔扇贝（Chlamys farreri）抗病力指标的影响

通过室内模拟实验研究了海水盐度突降对栉孔扇贝抗病力的影响.设盐度20、25两个处理,以盐度31为对照.将扇贝从盐度31的暂养海水直接转到设计盐度,分别于0h、1h、4h、12h、24h、48h、72h采血分析血细胞数目、血浆蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、酸性磷酸酶（ACP）活性.72h注射细菌攻毒,记录存活率.结果表明,盐度突降使血细胞数和SOD活性总体下降,而血浆蛋白含量和ACP活性总体升高.攻毒引起的上述抗病力指标的变化趋势与盐度突降相同,但处理组的响应幅度均低于对照,存活率显著降低.上述结果说明盐度突降损害了栉孔扇贝抵抗感染的能力.

栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据栉孔扇贝(Chlamys farreri)急性病毒性坏死病毒(Acute viral necrobiotic virus,AVNV)的基因序列,选择保守区段,应用Beacon Designer 7.0软件设计了一对能特异性扩增90bp片段的引物和TaqMan探针,建立并完善了AVNV荧光定量聚合酶链式反应(Fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)诊断方法。该方法在108～102病毒拷贝范围内有较好的线性关系,AVNV拷贝数(X)和循环数(C)t的相关关系为:lgX=-0.29Ct+13.28(相关系数R2=0.998);检测AVNV的灵敏度为102拷贝;特异性实验表明只对AVNV基因组呈阳性反应。应用FQ-PCR对76份采自夏季发病期前后的栉孔扇贝样品进行检测,结果发现68份样品检测结果为阳性,阳性检出率为89.47%,高于普通PCR的阳性检出率(80.26%)。研究结果表明,该方法快速、灵敏,特异、重复性良好且能实现AVNV的定量检测,对AVNV的快速诊断和分子流行病学的调查以及AVNV疫情监测具有重要意义。

栉孔扇贝与海胆和海参混养的净化水质作用

在容水40 L、放养5个海参、混养10、20或30个海胆的水槽中分别加入0、1、2、4或6个壳长(6.65±0.30)cm的栉孔扇贝,研究了扇贝密度对净化海胆和海参混养池水质的作用。结果表明:扇贝密度极显著影响水体的叶绿素、氨氮、颗粒有机物(POM)和悬浮颗粒含量(P<0.01);显著影响水体的总颗粒物(TPM)含量(P<0.05)。每升水放养0.05个扇贝的水槽(即2个/水槽)中叶绿素的含量[(0.282±0.060)μg.L-1]显著高于其他各组(P<0.05),POM[(3.68±0.61)mg.L-1]和TPM[(13.47±0.92)mg.L-1]含量显著低于其他组(P<0.05)。扇贝放养后第2-3 d氨氮、POM、TPM和悬浮颗粒的含量显著增加,第3 d后保持相对平稳。

栉孔扇贝wnt4基因cDNA克隆及表达分析

由栉孔扇贝(Chlamys farreri)转录组数据库获得wnt4基因的一段表达序列标签(EST)序列,利用SMART-RACE技术克隆了wnt4基因cDNA全长序列,该序列长1 239 bp,其中开放阅读框为1 068 bp,可以编码355个氨基酸,推导的氨基酸序列含有WNT家族特有序列,且与沙蚕(Platynereis dumerilii)、海胆(Heliocidariserythrogramma)、人(Homo sapiens)等物种WNT4同源性都在60%以上。半定量RT-PCR结果显示,除肾脏外,wnt4基因在栉孔扇贝的精巢、卵巢、闭壳肌、肝胰腺、鳃、外套膜组织中均有表达,但表达量较低。定量RT-PCR结果表明:wnt4基因在成熟期的精卵巢中表达量最高,增殖期和休止期表达量次之,生长期表达量最低;整个生殖周期中精巢表达量高于卵巢。该基因在栉孔扇贝多个组织中的表达特性,暗示其参与了多样的生物学过程;在性腺中的表达特征表明其可能参与两性性腺的发育并在生殖细胞成熟过程中发挥作用。

海洋无脊椎动物组织总RNA提取方法的探讨

RNA提取是分子生物学研究的基础实验,由于海洋无脊椎动物组织结构以及体成分的特殊性,导致现有的RNA提取方法不能完全胜任此工作。作者以刺参（Apostichopus japonicus）、栉孔扇贝（Chlamys farreri）和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象,对异硫氰酸胍RNA提取方法进行了改进。栉孔扇贝和凡纳滨对虾的肝胰腺富含RNase,刺参体壁结构致密、富含胶原蛋白,而成熟期精巢富含多糖,因此在这些动物组织中提取RNA时,在原有方法基础上增加了瞬时匀浆、增加氯仿及酸性酚的抽提次数,或添加高盐溶液等方法。实验结果显示,改进方法后获得的RNA具有完整的28S、18S和5S r RNA条带,A260nm/A280nm和A260nm/A230nm比值分别为1.89~2.0和1.98~2.11,β-actin基因扩增条带清晰,所获得的组织RNA的纯度和质量符合c DNA合成和基因功能研究的要求。

桑沟湾养殖栉孔扇贝食物来源研究——脂肪酸标志法

运用脂肪酸标志法分析了桑沟湾养殖栉孔扇贝(Chlamys farreri)春、夏季食物来源组成。结果表明,桑沟湾养殖栉孔扇贝饵料组成中含有硅藻类、细菌、大型绿藻类、鞭毛藻类等饵料来源,且各种饵料来源比例具有较显著的季节变化。采样期间硅藻脂肪酸标志16:1/16:0(相对质量分数比,下同)从0.91降至0.45,表明扇贝硅藻类饵料来源比例呈逐渐下降趋势;细菌脂肪酸标志18:1n-7/18:1n-9比值从0.31升至0.90,奇数碳、支链脂肪酸相对质量分数从2.15%升至3.28%,表明扇贝细菌类饵料来源比例呈逐渐上升趋势;绿藻脂肪酸标志Σ(18:2n-6+18:3n-3)质量分数从2.78%升至5.77%,表明大型绿藻来源有机质饵料比例逐渐上升。栉孔扇贝脂肪酸组成中较高比例的DHA表明扇贝摄取了富含DHA的有机质,如鞭毛藻类、微型浮游动物等。栉孔扇贝食物来源的季节变化很可能是由水体中潜在食物来源的季节变化所导致。

栉孔扇贝热休克蛋白70(HSP70)基因的BAC-FISH定位

利用BAC-FISH技术,将包含HSP70基因的BAC克隆定位到栉孔扇贝的一对同源染色体的长臂上。HSP70基因的染色体定位将对深入研究该基因的结构及功能并将其应用于生产实践提供基础支持。同时,本研究是首次对栉孔扇贝低拷贝基因进行染色体定位的实践,其结果将为栉孔扇贝的染色体的深入研究以及染色体鉴别等工作提供必要的参考。

鳗弧菌注射对栉孔扇贝免疫活性的影响

测定了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)注射对栉孔扇贝(Chlamys farreri)胞内活性氧(ROS)含量和过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。结果表明,在注射后5、24、48和72h各免疫指标都有明显变化;胞内ROS含量在24、48和72h明显升高,且均高于对照组,形成抛物线趋势,在48h达到最高;血清中CAT活性均有升高趋势;肝脏中ACP活性在24、48和72h与注射生理盐水组相比明显升高;栉孔扇贝体内ALP活性有明显升高的趋势,且在注射后24h活性达到最高,而后有所下降。结果表明,鳗弧菌对栉孔扇贝免疫系统有明显的刺激作用。

栉孔扇贝、虾夷扇贝及其杂交子代的群体遗传多样性分析

采用扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)标记对栉孔扇贝(Chlamys farreri,♀)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis,♂)及其F1群体的遗传多样性进行分析。5对引物组合共扩增得到315个位点,其中311个为多态位点,总的多态位点比例为98.73%。栉孔扇贝、虾夷扇贝及其F1群体的Shannon信息指数分别为0.477 1±0.260 6、0.423 9±0.277 7、0.548 8±0.220 9;3个群体的Nei’s基因多样性指数分别为0.329 1±0.185 0、0.289 7±0.195 9、0.382 8±0.161 2,表明杂交子代群体的遗传多样性水平比2个亲本群体都高。栉孔扇贝与虾夷扇贝群体间的遗传距离为0.411 6,栉孔扇贝与F1群体间的遗传距离是0.131 6,虾夷扇贝与F1群体间的遗传距离是0.278 0,表明杂种子代与母本栉孔扇贝遗传距离较近。聚类分析显示,虾夷扇贝群体、栉孔扇贝群体以及F1群体的所有个体分别聚到一起,且都形成独立群体;分子方差分析(AMOVA)结果显示,变异来源有30.47%来自群体间,有69.53%来自群体内,表明群体内的遗传多样性比较丰富。杂种优势的产生与群体遗传多态性有关。

温度、盐度对栉孔扇贝(Chlamys farreri)胚胎和幼虫的影响

采用温度和盐度单一和组合因子设计实验方法,系统地研究了温度、盐度对栉孔扇贝胚胎和幼虫的影响。结果表明,栉孔扇贝胚胎发育适宜温度为16.0—22.0℃,盐度为27.5—32.5;最佳温度为18.0—22.0℃,盐度为30.0—32.5;幼虫培育适宜温度为16.0—26.0℃,盐度为27.0—39.0;最佳温度为19.0—22.0℃,盐度为27.0—32.0。相对而言,栉孔扇贝胚胎和幼虫对低温高盐适应能力较强,温度显著影响胚胎孵化和幼虫发育,盐度显著影响幼虫生长;二者组合影响对胚胎孵化不显著;随着幼虫的发育,组合影响对幼虫存活十分显著;对幼虫生长不显著。

中国北方海域扇贝重金属含量的比较与质量评价

于2005年10～11月在大连湾、秦皇岛、莱州湾、烟台、威海、胶州湾、胶南7个海域,进行了海湾扇贝(Argopecten irradians)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)As,Hg,Pb,Cu,Zn5种重金属含量的调查。重金属含量的测定采用原子吸收法进行。结果表明:(1)重金属含量存在着组织差异性,贝边的含量高于贝柱;(2)取自同一海域的栉孔扇贝重金属含量高于海湾扇贝;(3)5种重金属的平均含量排序为:Zn>Cu>As>Pb>Hg;(4)胶州湾栉孔扇贝Zn有超标现象,贝柱和贝边中的含量分别是限量标准的1.24倍和1.59倍;Hg,Pb,As和Cu均未超标。

栉孔扇贝雌核发育二倍体早期成活与生长发育的研究

利用筛选出的精子遗传失活法和卵染色体加倍法,批量诱导出第二极体抑制型栉孔扇贝雌核发育二倍体个体,观测了幼体不同发育时期的成活率、发育速度和个体大小等生物学特性。结果发现,雌核发育二倍体的卵裂率、胚胎畸形率、D形幼虫发生率、孵化后3,6,9,12,15,18 d的成活率均显著低于对照组,表明栉孔扇贝基因组中可能存在大量有害隐性基因,雌核发育个体中有害隐性基因的纯合导致了成活率的显著下降。在发育速度方面,D形幼虫期之前,雌核发育二倍体个体明显低于对照组个体;壳顶期后则相反,雌核发育二倍体个体高于对照组个体。在个体大小方面,雌核发育二倍体个体在孵化后3 d前,壳长和壳高均小于对照组个体;孵化3 d后,壳长和壳高逐渐大于对照组个体。这一结果显示随着致死隐性基因因纯合而被自然排除,雌核发育二倍体的生长性状逐渐优越于正常个体,通过将这些雌核发育二倍体个体培养至成体,则可望培育出栉孔扇贝的优良品系。

栉孔扇贝对无机砷的富集与排出特征研究

以栉孔扇贝(Chlamys farreri)为试验生物,应用生物富集双箱动力学模型,研究了暴露在不同质量浓度的As3+溶液中,栉孔扇贝对无机砷的耐受性;通过对富集与排出过程中栉孔扇贝体内无机砷含量的动态监测及对检测结果的非线性拟合,得出栉孔扇贝富集无机砷的吸收速率常数(k1)、排出速率常数(k2)、生物富集因子(BCF)、生物半衰期(B1/2)等动力学常数。试验结果显示,扇贝对无机砷的吸收速率(常数k1)随着外部水体中As3+质量浓度的增大呈减小趋势,而吸收速率(常数k2)与水体中As3+质量浓度无明显相关性;生物富集系数BCF随着外部水体As3+质量浓度的增大而减少;平衡状态下栉孔扇贝体内无机砷含量(CAmax)与暴露水体中的As3+质量浓度之间呈较强的线性相关(R2=0.926 7);栉孔扇贝对无机砷排出率较高,代谢30 d后,排出率可达到84.17%;无机砷在栉孔扇贝体内的生物半衰期较短。根据试验结果推算出,在二类海水水质标准下养殖的栉孔扇贝符合食用标准。

栉孔扇贝血淋巴中谷胱甘肽还原酶的活性研究

用酶标仪采用DTNB比色法测定栉孔扇贝(Chlamys farreri)血淋巴中谷胱甘肽还原酶(GR)的活性,并研究pH值、温度、激活剂和抑制剂对血清中该酶活性的影响及酶的热稳定性。结果表明,栉孔扇贝血细胞中GR比活力明显高于血清。血清中GR的最适pH值因缓冲液的不同而稍有差异:用PBS为缓冲液时,最适pH值为7.0;Tris-HCl为缓冲液时,最适pH值为7.5。酶的最适温度为60℃。将血清在20℃,30℃,40℃,50℃,60℃,70℃和80℃温度的水浴中放置30min后于20℃,pH7.5条件下测定该酶的热稳定性,结果显示50℃时酶的比活力最高,低于或高于此温度的酶比活力均下降,80℃时酶活性完全丧失。栉孔扇贝血淋巴中GR属中温型中性酶类,低温下较稳定。EDTA对该酶活性有促进作用,硫酸铜有抑制作用。

扇贝糖蛋白及多糖对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

目的:研究扇贝糖蛋白及扇贝多糖对S180小鼠的抑瘤作用。方法:给小鼠接种S180腹水瘤,用不同剂量扇贝糖蛋白及扇贝多糖治疗,观察瘤重及脾脏重量。结果:40 mg·kg-1扇贝糖蛋白对S180小鼠抑瘤率为47．29％,20 mg·kg-1扇贝多糖抑瘤率为46．97％;扇贝多糖还可明显增加小鼠脾脏重量。结论:扇贝糖蛋白及扇贝多糖抑瘤效果显著,扇贝多糖还具增强免疫功能作用。

微卫星评价栉孔扇贝雌核发育二倍体纯合性

采用筛选获得的5对多态性微卫星引物对栉孔扇贝(Chlamys farreri)减数分裂雌核发育家系A和家系B、有丝分裂雌核发育家系A和家系B各30个个体、双亲及对照组40个个体进行了遗传变异分析,并对减数分裂和有丝分裂雌核发育后代的纯合性进行了比较。电泳结果表明,5对微卫星引物在减数分裂雌核发育和有丝分裂雌核发育个体中均能稳定重复地扩增出相应的序列;各雌核发育家系中均有部分个体出现父本基因,表明精子遗传物质失活不彻底,雌核发育组中存在正常受精个体;有丝分裂雌核发育二倍体在所有检测位点全部纯合,减数分裂雌核发育二倍体在部分位点纯合,但未发现在所有位点全部纯合的个体,在CFMSP007、CFMSP075、CFMSM009、CFMSM014和CFMSM020位点,杂合子比例分别为0.3400、0.3611、0.4884、0.4750和0.7500,平均杂合子比例为0.4829。研究结果显示,栉孔扇贝有丝分裂雌核发育二倍体均为纯合子,如精子的灭活率达到100%,有丝分裂雌核发育二倍体一代即可实现纯合,如再进行一次减数雌核发育即可建立纯系;减数分裂雌核发育二倍体由于具有较高的重组率,其与母本的遗传同质性较高。