微量板杂交法和斑点杂交法检测菊花矮化类病毒的比较

利用狄高辛(DIG)标记制备菊花矮化类病毒(CSV)特异性探针,由反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行CSV RNA的反转录和cDNA的扩增,然后比较2种核酸杂交方法——微量板杂交和斑点杂交检测CSV的灵敏度。本研究结果表明,30 mg干燥样本抽提的CSV RNA被稀释400倍,取4 μL(约750 pg样本抽提的RNA)经RT-PCR,其产物再用10×SSC稀释100倍,采用微量板杂交仍可以很容易得到阳性结果,而采用斑点杂交法,同样条件下PCR产物被稀释8倍就不易得到阳性结果。所以,微量板杂交法比斑点杂交法具更高的灵敏度。

菊花矮化类病毒的分子检测与序列分析

菊花矮化病由菊花矮化类病毒(Chrysanthemum stunt viroid,CSVd)引起。从北京、海南万宁、合肥和哈尔滨共采集了122个野生及商业种植的菊花样品,使用改进的CTAB法提取菊花总RNA后,通过斑点杂交检测CSVd,应用RT-PCR对阳性样品进行克隆、测序。斑点杂交结果表明,在检测的122个样品中有14个样品感染了CSVd,感染率为11.5%;除哈尔滨外的其余3个地区均有CSVd的发生。序列比较分析结果表明,中国的CSVd分离物与韩国和日本分离物的序列最为接近,对其二级结构进行分析发现,与CSVd的参考序列(NC002015)相比,所获得的中国CSVd分离物的序列中虽然有21个碱基发生了突变(大多位于二级结构上的致病区内),但并未影响其折叠成稳定的拟棒状结构。

属级芯片筛查技术在马铃薯纺锤块茎类病毒属检测中的应用

建立马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)类病毒有效的芯片筛查技术,对该属类病毒进行筛查。分析了该属类病毒序列,得到19条具有属级鉴定特征的探针。这些探针符合GC含量在40%与60%之间、单个核苷酸含量不大于50%、无多于4个核苷酸的连续重复及不形成多于6个核苷酸的发卡结构的标准;将探针点制到玻璃片基上制备芯片。芯片探针有效性实验结果表明,菊花矮化类病毒(Chrysanthemum stunt viroid,CSVd)及番茄雄性株类病毒(Tomato planta macho viroid,TPMVd)样品杂交可获得有效信号;灵敏度实验结果表明,该芯片可检测到200 pg/μL的总RNA。该芯片可用于Pospiviroid类病毒的筛查。