草鱼MHCⅡα基因cDNA的克隆与组织表达分析

采用快速扩增cDNA末端方法,获得1007bp草鱼MHCⅡα基因全长cDNA片段,序列包括717bp的开放阅读框、34bp的5′端非编码区以及256bp的3′端非编码区.氨基酸序列比对和同源性比较分析结果表明,草鱼MHCⅡα与鲤鱼MHCⅡα相似性最高,为79%,与斑马鱼的相似性为75%,与人的相似性最低,为34%.RT-PCR组织表达分析,MHCⅡα基因在正常草鱼组织中除了肌肉中没有扩增出MHCⅡα基因转录本外,在所检测的其他组织中都有不同程度的表达,其中脾脏、头肾有较强的表达,血液有中等程度的表达,肝脏、眼与肌肉相对表达较弱.

大菱鲆MHCⅡB基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法，得到了1297bp的大菱鲆MHCⅡB全长cDNA片段。该序列包括741bp的开放阅读框（ORF），35bp的5’末端非编码区（UTR）以及521bp的3’末端非编码区。序列比对结果表明，大菱鲆MHCⅡB与牙鲆MHCⅡB的同源性高达71．5％，与真鲷、鲈鱼和丽鱼的同源性分别为67．1％，70．7％和68．4％，与人、鼠和鲨鱼MHCⅡB的同源性仅分别为24．1％，25．1％和13．2％。组织表达研究显示，MHCⅡB基因在正常大菱鲆组织中均表达，但表达量在各个组织中不同，其中较强的表达于鳃、脾、头肾、小肠中．中等程度表达于血、心脏和皮肤，在肝、性腺和肌肉中表达最弱。

甘蔗硫氧还蛋白基因ScTRXh1的克隆及表达特性分析

硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)家族是一类古老的小分子蛋白,已被证明在维持生物体内氧化还原平衡、调控生物信号传导和应答多种非生物逆境胁迫中起重要作用。本研究从甘蔗(Saccharumcomplex)茎全长cDNA文库中分离克隆了一个甘蔗硫氧还蛋白h型基因的cDNA全长序列,命名为ScTRXh1。ScTRXh1全长786bp,5'非翻译区长96bp,3'非翻译区长306bp,开放读码框长384bp,共编码127个氨基酸。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗中ScTRXh1基因的表达在处理前期分别受到ABA的抑制和H2O2的促进;PEG和NaCl胁迫处理对ScTRXh1基因表达的影响不显著;甘蔗中ScTRXh1基因的表达受SA的诱导而显著上调,其表达丰度在处理周期内维持在对照的6倍以上。以上结果表明ScTRXh1基因参与了甘蔗对SA、ABA和氧化胁迫等逆境因子的应答过程。甘蔗不同组织器官的定量表达结果分析表明,ScTRXh1基因在甘蔗根、茎和芽中的相对表达丰度高,分别是其在叶中的33倍、17倍和12倍以上。本研究结果为后续TRX基因在甘蔗抗逆相关机理研究和抗逆育种中的应用奠定了基础。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)MHCⅡA基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法,得到1131bp的大菱鲆MHCⅡA全长cDNA片段。该序列包括720bp的开放阅读框(0RF),75bp的5′末端非编码区(UTR)以及336bp的3′末端非编码区。利用CLASTAL W1.8软件进行MHCⅡA基因的氨基酸序列比对和同源性比较,结果表明,大菱鲆MHCⅡA与牙鲆MHCⅡA的相似性最高,为69.8%,与真鲷、鲈鱼和丽鱼的相似性次之,分别为65.5%、69.6%和61.4%,与人、鼠和鲨鱼MHCⅡA的相似性仅为19.8%、31.6%和26.9%。应用RT-PCR分析其组织表达发现MHCⅡA基因在正常大菱鲆组织中均表达,但表达量在各个组织中不同,其中在鳃、脾、头肾、心脏、小肠和皮肤中有较强的转录本,中等程度表达于肝和血,在性腺和肌肉中表达最弱。

绒山羊Scp3基因的克隆及睾丸中第一轮减数分裂的发生

联会复合体蛋白3(synaptonemal complex protein 3,Scp3)是雄性生殖细胞减数分裂中联会复合体形成必需的组成部分,在哺乳动物生殖细胞减数分裂中具有重要功能。通过RT-PCR扩增和分子克隆的方法首次克隆到了绒山羊Scp3基因的编码区片段。测序结果表明,绒山羊与牛的Scp3基因编码序列同源率达到98%。根据测得的DNA序列,设计引物,用RT-PCR方法分析测定了青春前期绒山羊不同个体中睾丸组织的Scp3的转录表达。结果显示,雄性绒山羊青春前期睾丸发育存在个体差异,已分析的样品第一轮减数分裂发生的时间普遍为73天之后。这一结果为绒山羊的睾丸发育和精子发生过程的相关研究打下了基础。

栽培大豆染色体改构复合体基因SNP5的克隆及序列分析

根据大豆耐盐基因表达芯片上提供的表达量下调的EST序列信息,借助了电子克隆方法,根据获得的假定序列设计引物,通过RT-PCR,从栽培大豆克隆了染色体改构复合体SNP5类同源基因。其片段长度为812bp,编码240个氨基酸的多肽,分子重量为27.4kD,等电点pI为5.37。NCBI保守结构域分析表明,其属于SNF5超家族,因此我们将其命名为Gm-SNP5(GenBank登录号:HM068595)。Southern杂交表明,GmSNF5基因在栽培大豆基因中至少有一个拷贝。氨基酸序列及系统进化树分析表明,GmSNF5与其同科的豌豆PsSNF5有较高的同源性,氨基酸序列一致性高达92%。由于其部分EST序列在大豆耐盐芯片中表达量下调,因此推测此基因在功能上与栽培大豆的耐盐性相关。

三角鲂MHCⅠα基因全长cDNA克隆与生物信息学分析

主要组织相容复合体(major histocompatibility complex,MHC)是一类具有高度多态性的分子,在脊椎动物的先天免疫应答中起到重要作用。根据已报道鱼类的MHCⅠα基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR和RACE技术克隆三角鲂MHCⅠα基因cDNA序列全长,命名为Mete-UAA,并对其进行生物信息学分析。结果显示,Mete-UAA全长为2102 bp,包含1044 bp的开放阅读框,编码347个氨基酸。编码的MHCⅠα蛋白质预测分子量为38699.18,等电点5.23,含有16个氨基酸组成的信号肽,具有亲水性,定位于细胞膜上,具有1个N-糖基化、3个O-糖基化和39个磷酸化的潜在位点。氨基酸序列同源性比对发现,Mete-UAA氨基酸序列与团头鲂同源性最高为75.79%,与草鱼同源性稍低于团头鲂,为75.25%。Mete-UAA具有MHCⅠα的典型结构特征,包含1个前导肽、3个胞外结构域、1个跨膜区和1个胞质区。二级结构分析显示,Mete-UAA蛋白质中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为25.94%、9.22%、26.80%和38.04%。基于转录组学分析表明,感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后三角鲂MHCⅠα基因表达呈总体下降趋势。本研究从三角鲂肝中成功克隆MHCⅠα基因,分析了其生物信息学特征,为后续研究MHCⅠα参与调控三角鲂先天免疫应答的机制提供理论基础。

中华鳖群体间编码MHCⅠ类分子α_2结构域基因的克隆及序列分析

通过主要组织相容性复合体（MHC）基因的分析，探讨了中华鳖5个群体（黄河、淮河、洞庭湖、鄱阳湖、太湖）间的遗传变异与分化。中华鳖编码MHCⅠ类分子α2结构域基因的多态性很丰富。主要表现在：（1）中华鳖编码MHCⅠ类分子α2结构域的基因序列存在插入或缺失变异，共获得7种不同长度的基因序列，其中222bp、231bp分别在42、23个体出现，为两种主要长度的基因序列；（2）共获得41种不同的核苷酸序列，这些核苷酸序列的相似度在0．386—0．995之间，表明序列间的歧异度较大；（3）在所有核苷酸序列中，共有250个有效位点，其中174个为变异位点，多态位点百分率达69．6％，但群体间存在差异：①多态位点百分率大小顺序为鄱阳湖鳖（71．02％）〉太湖鳖（58．05％）〉淮河鳖（57．69％）〉黄河鳖（55．32％）〉洞庭湖鳖（48．09％）；②核苷酸多样性指数（π）大小顺序为鄱阳湖鳖（0．4273）〉太湖鳖（0．2872）〉洞庭湖鳖（0．2840）〉黄河鳖（0．2727）〉淮河鳖（0．2463）；（4）分子方差分析（AMOVA）表明，太湖鳖与黄河鳖、淮河鳖2群体间，淮河鳖与洞庭湖鳖间有极显著的遗传分化（P〈0．001）；（5）根据核苷酸序列的平均遗传距离，用UPGMA和NJ法进行聚类分析，黄河鳖与淮河鳖、洞庭湖鳖与太湖鳖分别先聚在一起，最后再与鄱阳湖鳖聚类，显示鄱阳湖鳖与其它4群体中华鳖在MHC基因上有明显歧化。

三疣梭子蟹氧化磷酸化代谢在家系近交中的变化

为探究近交对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)氧化磷酸化代谢的影响,首先克隆了三疣梭子蟹线粒体呼吸链4个复合体关键亚基基因的c DNA全长,分别命名为pt Ndufv2、pt SDHC、pt Cytochrome c1与pt COX6B。pt Ndufv2基因c DNA全长1005 bp,编码234个氨基酸,该蛋白是复合体Ⅰ的核心亚基Ndufv2;pt SDHC基因全长915 bp,编码由179个氨基酸组成的复合体Ⅱ关键亚基SDHC;pt Cytochrome c1基因全长2371 bp,编码由313个氨基酸组成的亚基Cyt c1;pt COX6B基因全长1171 bp,编码由105个氨基酸组成的COX6B亚基。生物信息学分析显示,这些复合体亚基基因进化上比较保守。酶活检测及RT-PCR结果表明,随着近交系数的增加,三疣梭子蟹肝胰腺中复合体Ⅰ、复合体Ⅲ活力分别从F4、F2开始呈现显著下降趋势(P<0.05);F10复合体Ⅳ酶活力显著低于其余各代(P<0.05);4个复合体基因表达量均显著下降,且各代表达量显著低于F0(P<0.05)。在心脏中,复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活力分别从F2、F2、F6开始显著下降(P<0.05);pt Ndufv2与pt Cytochrome c1基因表达量分别从F2、F4开始显著下降(P<0.05),这一结果证实近交衰退已出现在三疣梭子蟹氧化磷酸化代谢通路。

黄鳝主要组织相容性复合体Iα基因的克隆及多态性分析

通过同源克隆，结合RACE技术，从黄鳝肝脏cDNA中分离得到了MHC 1α因的全长cDNA序列。结果表明：黄鳝MHC 1α因cDNA全长1731bp，5＇UTR长78bp，3＇UTR长600bp，编码1条350个氨基酸的多肽；与其他鱼类不同，黄鳝血基因只具有4个外显子和3个内含子。二级结构分析结果表明，该基因具有MHC尼基因的典型特征和保守区域。实时荧光定量PCR检测结果表明：黄鳝MHC 1α因在不同组织中表达量的差别较大；嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilia）感染可显著影响黄鳝肝脏、肾脏和脾脏MHC 1α因的表达。对42个个体MHC 1α因外显子3序列的测定结果表明，42个个体共分离到50个等位基因，每个个体包含1～6个等位基因，推测黄鳝具有至少3个血基因座位；等位基因PBR位点和非PBR位点的氐值均显著大于ds（P〈0．05），提示黄鳝胁基因曾经历过强烈的正选择作用。

615小鼠H-2K^k基因cDNA的克隆及序列测定和分析

目的 :克隆 6 15小鼠主要组织相容性复合体 (MHC)Ⅰ分子抗原识别基因H_2Kk 并测序分析 ,为转基因治疗提供目的基因。方法 :采用RT_PCR法从 6 15小鼠肝组织总RNA中获得 1 4kb的H_2Kk 基因cDNA ,将其定向连接至PGEM3Zf(+)载体 ,转化E coliJM10 9,限制性内切酶筛选出阳性克隆PGEM3Zf(+)_H_2KkcDNA ,末端终止法完成H_2KkcDNA的全序列测定。结果 :测得的H_2KkcDNA序列与文献报道序列同源性高达 99% ,编码MHCⅠ分子抗原识别部位的氨基酸残基的核苷酸序列完全相同。结论 :成功克隆了 6 15小鼠MHCⅠ分子抗原识别基因 。

三七愈伤组织的培养

在MS培养基中加入不同浓度的KT和2,4-D,综合考虑三七愈伤组织生长缓慢兼顾皂甙含量,较合适的KT浓度为0.7ppm,较合适的2,4-D浓度在2—3ppm之间。在培养基中补充各种添加剂,结果以椰子乳和水解乳蛋白较好。综合生长和皂甙含量以20％的椰子乳和0.7％的水解乳蛋白较合适。从21个三七愈伤组织无性繁殖系中筛选山了5个较优的无性系,特别是其中04号无性系更优,无论生长速率还是总皂甙含量都更高。通过以上研究,使三七愈伤组织的生长速率达220毫克/升/天,是原初培养愈伤组织(54.0mg干重/升/天)的4倍。愈伤组织中总皂甙含量高达13％,是原初培养愈伤组织(5.37％)的2.4倍,为原植物的3倍。从而证明了三七培养组织次级代谢的全能性是可调节的,为三七细胞工程的工业生产应用打下了初步基础。

玉米秸秆高效腐解复合菌系CSS-1的选育及其组成分析

【目的】选育在常温(22℃)下对玉米秸秆具有高效稳定腐解功能的微生物复合菌系,明确其菌群组成,以促进选育的复合菌系在中国北方原位还田玉米秸秆中的应用。【方法】采用限制性培养与温度梯度诱导相结合的方法,以山西、山东、北京等省(市)玉米秸秆连续多年还田的土壤样品为菌源,以秸秆失重率、C/N及CMC酶活为筛选指标,获得高效稳定的玉米秸秆腐解复合菌系CSS-1;比较复合菌系不同继代腐解秸秆的失重率、CMC酶活、木聚糖酶活和PCR-DGGE的菌群监测动态变化,评价CSS-1的功能及其组成稳定性;采用克隆文库法,解析复合菌系CSS-1的主要菌群组成。【结果】CSS-1处理玉米秸秆的CMC平均酶活和最高酶活,比目前广泛应用的秸秆腐解菌剂A分别提高了82%和79%;CSS-1处理的秸秆失重率比菌剂A和空白对照分别提高了62.62%和173.65%;CSS-1不同继代腐解秸秆功能及其菌系组成监测表明该复合菌系的稳定性;克隆文库方法显示CSS-1优势菌群由多种具有纤维素与半纤维素降解功能的细菌和真菌构成,其细菌菌群分别归属Enterobacter、Cellulomonas、Streptomyces、Bacillaceae、Pantoe、Cellvibrio6个属,真菌菌群归属Trichoderma、Gibberella2个属。【结论】获得了在中国北方地区常温条件下高效稳定腐解玉米秸秆的复合菌系CSS-1,可研发利用该菌系促进田间原位还田玉米秸秆的快速腐解。

基于PasteurMLST网站分析中国单增李斯特菌克隆复合体的多样性

为了了解中国分离的单增李斯特菌克隆复合体的多样性,利用了PasteurMLST网站上公布的数据,获得了1987—2015年具有序列型(Sequence type,ST)的来自中国的单增李斯特菌53条菌株数据,进行了克隆复合体的多样性分析。结果表明:53条菌株数据中可分为44个ST型,以ST 705型居多(共6株,占总数的11.3%);所有提交菌株的来源广泛,以1/2a血清型为主,南方地区的菌株数与ST型数均多于北方地区。利用eBURST软件对数据进行总体分析,共发现了单个ST型18个,2个ST型的克隆复合体5个,4个ST型的克隆复合体1个,5个ST型的克隆复合体1个,7个ST型的克隆复合体1个,其中CC155是最大的克隆复合体(占总菌株的24.5%)。进一步分析得知克隆复合体与菌株来源关系密切。系统发育树分析得出CC9与CC155存在较近的进化关系,并且氨基酸序列构建的系统发育树比核苷酸更加准确。由此可见,基于PasteurMLST网站分析的中国单增李斯特菌具有较高的遗传多样性,MLST分型以ST 705为多,克隆复合体以CC155为主,这为进一步研究单增李斯特菌的溯源以及进化关系奠定了理论基础。

星斑川鲽MHC Ⅱ恒定链Ii基因的克隆和表达特性

为了研究星斑川鲽MHCⅡ类分子的作用及调控机制,实验通过SMART-RACE技术克隆得到了星斑川鲽MHCⅡ恒定链(MHCⅡIi)的全长cDNA序列,其长度为1766 bp,包含135 bp的5′非编码区、837 bp的开放阅读框和794 bp的3′非编码区。该基因共编码279个氨基酸。理论分子量为30.848 ku,等电点为6.89。与已知物种MHCⅡIi进行同源性比对,结果与狼鲈、紫红笛鲷和鳜关系较近,同源性均为79%。利用quantitative realtime PCR(qRT-PCR)技术检测了MHCⅡIi在星斑川鲽不同组织中的表达,以及爱德华氏菌感染前后对该基因在不同组织中表达水平的影响,结果显示:在脾脏、头肾、肝脏、后肠、性腺、心脏、血液、鳃和肌肉组织中,MHCⅡIi mRNA均有表达,但在表达量上有明显差异,脾脏和头肾组织相对表达水平较高,鳃、血液、肌肉、心脏和性腺中的表达水平较低。病原感染后,免疫相关组织脾脏和头肾的表达水平升高最明显,肝脏和后肠的表达水平也略有升高,但变化不明显。本研究可为星斑川鲽MHCⅡ类分子的作用机理提供理论依据,同时为海水养殖鱼类的抗病遗传育种工作提供研究基础。

BALB/c小鼠H-2K^d胞外段基因cDNA的克隆及序列测定

目的克隆小鼠H-2K^d胞外段基因,构建相关表达载体。方法通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从BALB/c品系小鼠(H-2K^d)脾细胞中扩增出目的基因,构建载体后进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果克隆基因产物鉴定结果与理论预期值一致,DNA测序完全吻合。结论该实验克隆H-2Kd基因胞外段成功。

皱纹盘鲍伴侣蛋白CCTζ的分子克隆及其在不同锌含量日粮处理下的表达分析(英文)

伴侣蛋白CCT在蛋白折叠、抗胁迫以及调节细胞生长等生理过程中担负重要作用。研究利用同源克隆和RACE技术克隆了皱纹盘鲍伴侣蛋白CCTζ(HdhCCTζ)cDNA全长序列,并对CCTζ基因的序列特征进行了分析。HdhCCTζcDNA序列长1960 bp,开放阅读框为1599 bp,编码532个氨基酸,生物学软件推测其编码蛋白相对分子量为58.46 kD,等电点为6.53。BLAST分析结果表明HdhCCTζ与哺乳动物、鸟和鱼类等物种的CCT具有较高的同源性。生物信息学分析结果显示,HdhCCTζ蛋白序列中包含3个典型的CCT信号基序(35RTNLGPKGTLKML47,56LTKDGNVLLHEMQIQHP72和84QDDITGDGT92)以及1个腺苷三磷酸结合基序(89GDGTTS94)。此外,在HdhCCTζ蛋白序列中还包含3个糖基化位点(23NISA26,128NKSL131and234NVSL237)。实时荧光定量PCR检测结果显示,HdhCCTζ在皱纹盘鲍组织中为组成型表达,但主要集中在性腺、血淋巴和肝胰腺中表达。使用不同锌含量(6.69 mg/kg、33.85 mg/kg、710.63 mg/kg和3462.5 mg/kg)的日粮来饲喂幼鲍20周后,取其肝脏和血细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR技术进行HdhCCTζmRNA的表达水平分析。分析结果显示,随着日粮中锌含量的增加,HdhCCTζmRNA在血淋巴和肝胰腺中的表达水平呈现上调的趋势。相比于锌适量组(33.85 mg/kg),过量的锌(3462.5 mg/kg)却能够下调HdhCCTζmRNA的表达水平。上述结果表明,HdhCCTζ的表达受到日粮中锌添加量的影响,而高表达量的HdhCCTζ可能在提高皱纹盘鲍机体抗胁迫过程中发挥重要作用。

基于N进制编码的克隆重组方法应用于快速优化ADPCM的多参数

选择ADPCM的步长修正因子M涉及复杂目标函数的多变量优化,是一个海量计算问题。克隆—思维进化算法(CMEA)继承了进化算法(MEA)中趋同操作的择强汰弱思想,同时引入克隆算子将相对较弱个体的强势因素保留到下一代。提出一种新的基于N进制编码的克隆重组方法用于优化具有复杂目标函数的ADPCM的8个步长修正因子,实验结果表明从第5次迭代后,CMEA的信噪比(SNR)一直高于MEA算法;在前5次迭代中,CMEA平均每次迭代改善1.03dB,高出MEA算法0.4dB。此外MEA的计算量约为CMEA的1.67倍,CMEA比MEA算法抗早熟。

双抗体夹心法检测冠心病患者血清中肺炎衣原体循环免疫复合物的方法学建立

目的 建立一种敏感而特异的双抗体夹心法检测血液中循环免疫复合物(CIC),并探讨血液中肺炎衣原体(Cpn)CIC与冠心病的关系。方法 包被已知特异性鼠抗人CpnTW183IgG,加入用7％PEG6000,从冠心病患者血清中提取的CpnCIC,再加入酶标二抗与CIC中的抗体结合,通过底物显色检测患者CpnCIC阳性率。结果 冠心病组CpnCIC的阳性率(63.8％)高于对照组(40.0％),差异有显著性意义(X^2=7.78,P<0.05)。结论 建立的双抗体夹心法检测CpnCIC有较高的敏感性和特异性,可用于批量临床标本的检测,血清中中分子量CpnCIC的存在与冠心病之间有密切关系。

肠毒素大肠杆菌LTh－STIb二价基因探针的克隆及其应用研究

在肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）ＬＴｈ－ＳＴＩａ－ＳＴＩｂ三价基因探针的基础上，用限制性内切酶ＥｃｏＲｌ酶切，回收片段．重新构建ＬＴｈ－ＳＴＩｂ二价基因探针的克隆株。用辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰ）直接标记二价基因探针，建立了增强型化学发光反应（ＥＣＬ）检测ＥＴＥＣ的方法．其敏感性可测到０．１ｐｇ的质粒ＤＮＡ或由１０个菌体培养而来的ＥＴＥＣ细胞，与同位素标记杂交方法的敏感性一致．且此探针仅与产ＳＴＩｂ、ＬＴｈ肠毒素的人源性ＥＴＥＣ菌株杂交，与ＳＴＩａ肠毒素菌株及其它非ＥＴＥＣ菌株均无杂交信号．该探针与三价探针及ＬＴｈ单价探针联合使用，能间接将ＬＴｈ、ＳＴＩａ和ＳＴＩｂ３种肠毒素分型。结果表明该方法简便快速、特异敏感，无放射性污染，是ＥＴＥＣ实验室诊断及分子流行病学调查的有效工具。