结核分枝杆菌ClpC2基因序列分析及功能预测

目的对结核分枝杆菌的基因clpC2(Rv2667)的同源基因进行序列分析和相似性比较,并对其编码蛋白进行理化性质及功能的预测,为ClpC2蛋白的结构与功能研究提供基础技术资料。方法根据GeneBank中分枝杆菌clpC2同源基因的核苷酸序列,进行多重序列比对和进化树构建;应用ExPA Sy在线序列分析工具,对结核分枝杆菌ClpC2蛋白质理化性质及保守结构域进行预测;应用Gene ontology(GO)在线软件对ClpC2蛋白酶的功能进行分析。结果 clpC2系统进化树分析,与16 s rRNA基因相比,进化距离明显变大,而在结核分枝杆菌复合群中高度保守。ClpC2蛋白为亲水性非跨膜蛋白,在细胞质表达,具有水解和催化功能,是一个依赖于ATP的Clp亚单位。结论 clpC2基因在结核分枝杆菌复合群中高度保守,其编码的蛋白ClpC2是一个依赖于ATP的水解蛋白酶。

分枝杆菌表达质粒的快速构建及ClpC2基因功能初步研究

目的通过一种不受到序列限制、酶切连接反应一步进行的分子克隆方法,构建分枝杆菌Clp C2重组表达质粒,检测其在耻垢分枝杆菌中的蛋白表达并对其功能进行初步探讨。方法利用识别甲基化位点的内切酶Fsp EⅠ进行一步法酶切、连接反应,构建重组质粒PMV261(+)-Clp C2。将重组质粒转入耻垢分枝杆菌,利用SDS-PAGE和Western blot检测Clp C2基因在耻垢分枝杆菌中的表达以及氧化应激、酸应激对其功能进行初步探讨。结果利用Fsp EⅠ快速构建了分枝杆菌表达质粒Clp C2,将其成功电转至耻垢分枝杆菌中,SDS-PAGEA和Western blot检测其蛋白的表达,His单抗和兔多抗均能检测到目的条带,Mr大小27 570。氧化应激及酸应激实验表明Clp C2重组耻垢分枝杆菌与空载耻垢分枝杆菌在对抗应激方面无明显差异。结论成功构建了一种不受序列限制的分子克隆方法以及分枝杆菌Clp C2重组表达质粒,Western blot表明其具有一定的免疫原性,氧化应激及酸应激表明Clp C2重组耻垢分枝杆菌对抗应激方面无明显改变,为进一步深入研究Clp C2基因的功能奠定了基础。

结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2(ATP-dependent Clp regulatory subunit C2,ClpC2)基因的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增ClpC2基因,插入表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-ClpC2,经双酶切及测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,可与鼠抗组氨酸单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组表达质粒pET32a(+)-ClpC2,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpC2蛋白的生物学功能奠定了基础。