西瓜ClPP2C3克隆及表达分析

【目的】蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C,PP2C)是动植物中均存在的一类蛋白磷酸酶,拟探究其在西瓜果实成熟过程中发挥的重要作用。【方法】通过逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)从栽培类型西瓜‘97103’中克隆ClPP2C3,并对其进行生物信息学、表达模式和亚细胞定位分析。【结果】西瓜ClPP2C3的cDNA序列长度为1317 bp,编码438个氨基酸,其分子量大小为47.81 kD,蛋白质等电点为5.12。ClPP2C3包含1个PP2C保守结构域,与负调控果实成熟的番茄SlPP2C3、草莓FaABI1具有较高的同源性。西瓜ClPP2C3在细胞核表达。ClPP2C3在含糖量高的栽培品种中表达量显著高于含糖量低的野生品种。栽培品种ClPP2C3的2kb片段长度启动子活性显著高于野生品种,而1kb片段长度启动子活性之间无显著差异。【结论】由1-2kb区间SNP导致的启动子活性差异对不同含糖量品种ClPP2C3表达量存在影响。

变异链球菌的htrA和clpP基因对其生长和饥饿耐受的影响

目的:观察变异链球菌(下称变链菌)htrA-clpP双基因缺陷株的生长特点;比较缺陷株与标准株在饥饿条件下生长情况的差异。方法:将两菌株分别培养在含有10 g/L葡萄糖及无碳源的TPY培养基中,37℃微需氧条件下培养,从接种入培养基开始以2 h为间隔采用酶联免疫检测仪在600 nm下测定各菌株在两种生长条件下的生长曲线并比较其生长情况的差异,同时在各时间点使用葡萄糖氧化酶法试剂盒测定在含葡萄糖培养基中生长的两菌株耗糖情况并比较其差异。结果:①缺陷株在含10 g/L葡萄糖和无碳源TPY培养基中生长时,生长周期都发生了改变,对数期峰值提前且此阶段生长速度较标准株快(P<0.05),而标准株的对数期峰值及平台期A值均明显高于缺陷株(P<0.05);②标准株和缺陷株在无碳源条件下生长时细胞的生长能力较葡萄糖条件下明显降低(P<0.05);③缺陷株消耗葡萄糖的速度较标准株快(P<0.05)。结论:htrA和clpP基因缺陷可在一定程度上导致变链菌的生长及抗饥饿能力降低。

利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除

利用含有质粒pKD4 6的菌株BW2 5 113,在阿拉伯糖诱导后 ,表达λ噬菌体的 3个重组蛋白 ,宿主菌就具有了同源重组的能力 .设计的引物 5′端有 5 0bp的拟敲除基因的同源臂 ,3′端为扩增引物 ,以pKD3为模板 ,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因 ,将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞 ,利用氯霉素平板就可以筛选到阳性转化体 .再利用表达Flp重组酶的质粒pCP2 0 ,可将FRT位点之间的氯霉素抗性基因删除 .利用该重组系统 ,构建了ClpP蛋白酶缺失的大肠杆菌工程菌株 ,可望在减少外源蛋白的降解方面发挥一定的作用 .

clpP基因缺陷对肺炎链球菌毒力表达降低的研究

目的探索clpP基因缺陷对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)毒力的影响。方法用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法失活clpP基因,用PCR、Western blot鉴定缺陷菌株,通过RT-PCR分析自溶素(major autoly-sin A,lytA)、表面黏附A(pneumococcal surface adhesion A,psaA)、溶血素(pneumolysin,ply)和胆碱结合蛋白A(cholinebinding protein A,cbpA)的表达,并通过动物实验观察clpP基因缺陷株毒力改变情况。结果RT-PCR显示clpP缺陷株的4个毒力因子mRNA表达水平均低于野生菌,两者比较有统计学差异(P<0.05);小鼠毒力实验表明野生菌株半数致死时间为22h,而缺陷株半数致死时间为8d,两者比较有统计学差异(P<0.01);缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野生菌株(P<0.05)。结论clpP基因缺陷使S.pn多种毒力因子表达减弱,毒力降低。

肺炎链球菌毒力因子ClpP蛋白酶的体外表达及纯化

目的构建ClpP原核表达载体,获取原核表达的ClpP蛋白分子。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将完整的ClpP读码框克隆到pET-32a原核表达载体,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot鉴定,镍柱纯化并透析复性,真空冷冻干燥保存。结果测序结果证实克隆的基因与GenBank中的序列相符,Western blot证实获得了ClpP融合蛋白。结论获得了高表达的重组抗原蛋白,经镍柱纯化后纯度可达90%以上。

ClpP粘膜免疫预防小鼠发生肺炎链球菌性肺炎和败血症

目的:肺炎链球菌毒力蛋白ClpP鼻腔粘膜免疫BALB/c小鼠,探讨其作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗的价值。方法:利用制备的ClpP多克隆抗体,分析ClpP在肺炎链球菌表面表达情况;ClpP蛋白粘膜免疫小鼠,TIGR4型肺炎链球菌分别经腹腔和鼻腔攻击,分析肺炎链球菌小鼠肺内定植情况并监测小鼠生存时间。结果:流式细胞技术证实了TIGR4肺炎链球菌表面表达ClpP毒力蛋白,粘膜免疫ClpP可以特异产生系统性和粘膜性的ClpP抗体,并可减少TIGR4肺炎链球菌在小鼠肺内的定植,延长小鼠生存时间。结论:ClpP粘膜免疫可预防小鼠发生肺炎链球菌性肺炎和败血症,进一步证实ClpP蛋白可作为肺炎链球菌的候选蛋白疫苗。

牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株的毒力和免疫保护力评价

为研究布鲁氏菌clpP基因与细菌毒力的关系,采用同源重组的方法,构建牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株,用巨噬细胞RAW264.7感染模型和小鼠感染模型评价clpP基因缺失株的毒力,同时测定该缺失株免疫小鼠后产生的免疫保护力。研究发现:牛种布鲁氏菌clpP基因缺失后,在细胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力显著降低;clpP基因缺失株感染小鼠后,不引起脾脏肿胀,并且在脾脏内的持续期短于A19疫苗株,说明该基因缺失株具有更高的安全性;使用clpP基因缺失株免疫小鼠后,该基因缺失株无法抵御牛种布鲁氏菌2308株和羊种布鲁氏菌M28株的感染。本研究为揭示布鲁氏菌致病机制和新型布病疫苗研发提供了参考。

肺炎链球菌候选蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性

目的:评价酪蛋白裂解酶P(ClpP)作为候选疫苗的保守性和抗原性,分析在不同血清型肺炎链球菌(SPN)中的表达情况.方法:以TIGR4型SPN的ClpP基因序列设计引物,分别以12株不同血清型SPN的基因组DNA为模板,对ClpP基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增、胶回收产物与PMD-18克隆载体连接后进行测序,运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列及抗原性进行分析,并利用West-ernBlot方法检测12株不同血清型SPN的ClpP蛋白的表达情况.结果:12株不同血清型SPN的ClpP基因序列和Gen-Bank数据库对已公布的TIGR4型SPN的ClpP基因一致性>99.0%,推测的氨基酸序列一致性>99.5%.WesternBlot结果显示anti-ClpP多克隆抗体与12型SPN的菌体蛋白能够起交叉反应.结论:ClpP蛋白在不同型SPN之间同源性高,在不同型SPN菌株中均有表达.ClpP是一个具有前景的SPN候选蛋白疫苗因子.

铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株的构建

目的构建铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。方法分别以质粒pUCGM和铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板PCR扩增庆大霉素抗性基因(GM)和铜绿假单胞菌clpP基因及其3′、5′侧翼序列,将clpP基因及其3′、5′侧翼序列克隆至pMD19T载体,EcoRV切除clpP基因37bp^453bp片段后,引入庆大霉素抗性基因,构建重组质粒pCKR2;EcoRⅠ/HindⅢ双酶切重组质粒pCKR2,回收FclpP-GM-clpPR片段,与自杀质粒pEX18Tc连接,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pCKR3;将pCKR3质粒转化大肠埃希菌SM10,与铜绿假单胞菌PAO1双亲杂交,庆大霉素筛选得到铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。结果经酶切鉴定同源重组载体pCKR3构建正确;PCR和DNA测序鉴定铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株构建成功。结论本研究成功敲除了铜绿假单胞菌clpP基因,为进一步研究clpP基因的生物学功能奠定了基础。

胡萝卜软腐果胶杆菌clpP基因的功能研究

为探索clpP基因对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,P.c.c)生物学特性及致病性等方面的影响,采用同源重组法构建clpP基因缺失突变体ΔclpP和互补菌株ΔclpP(clpP),测定突变体及互补菌株的运动性、生物膜、抗氧化压力,以及在不同培养基和不同温度下的生长能力、部分致病因子活性及致病性等表型,并采用RT-PCR分析了果胶酸裂解酶(Pel)、纤维素酶(Cel)、蛋白酶(Prt)和坏死诱导蛋白(necrosis-inducing protein,Nip)等相关致病因子的编码基因转录水平变化。结果表明:ΔclpP的运动性无变化,生物膜形成、高温和营养饥渴耐受力及抗氧化压力等均下降;果胶酶、纤维素酶与蛋白酶活性有不同程度降低,酶活性检测平板上水解圈的直径分别比野生株下降19.35%、34.38%和35.00%;ΔclpP的致病性显著下降,离体接种‘黄花马蹄莲’叶片和大白菜叶柄,病斑面积分别比野生株的减小99.00%和99.60%;在4个毒力因子中,qRT-PCR显示:ΔclpP果胶酸裂解酶与纤维素酶mRNA相对表达量为野生菌株的40.00%左右。由此可见,clpP基因对胡萝卜软腐果胶杆菌的生长和致病性具有多方面的决定作用。

结核分枝杆菌ClpP1重组蛋白的特性探讨及初步应用

目的用纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)ClpP1重组蛋白免疫新西兰白兔制备ClpP1多克隆抗体并检测其效价,间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性,以初步评价其应用价值。方法通过SDS-PAGE确定ClpP1重组蛋白的主要表达形式,利用纯化包涵体方式对重组蛋白进行纯化;将纯化蛋白免疫新西兰白兔制备ClpP1多克隆抗体并检测其效价;再分别以纯化蛋白为抗原,制备抗体为一抗,间接ELISA法检测临床诊断结核病患者血清中抗M.tb抗体和M.tb抗原。结果 SDSPAGE显示ClpP1重组蛋白主要以包涵体表达形式存在,将纯化蛋白免疫新西兰白兔4次,取血测抗体效价为1∶64 000;Western blot结果显示制备抗体可较好的与ClpP1蛋白特异性结合;间接ELISA法结果表明,以重组蛋白为抗原测患者血清中抗M.tb抗体和以制备抗体为一抗测血清中的M.tb抗原的2实验组分别与对照组相比均具有显著性差异。结论制备了具有免疫原性的M.tb ClpP1重组蛋白及效价较高的多克隆抗体,并得出ClpP1多克隆抗体具有较好的免疫反应性,为进一步研究ClpP1重组蛋白的特性及其应用奠定了基础。

htrA和clpP基因缺失对变异链球菌铁代谢的影响

目的探讨高温需要蛋白A(htrA)和酪蛋白裂解酶P(clpP)单基因缺失对变异链球菌铁代谢的影响。方法采用浊度法测定变异链球菌标准株、htrA缺陷株和clpP缺陷株在0.1、0.2及0.3mmol/L铁限制条件培养基中培养24h的吸光度(A)值,并测定加入外源性铁或标准株分别与2种缺陷株在0.3mmol/L铁限制培养基中混合培养24h后的A值。结果与标准株相比,htrA缺陷株在浓度0.3mmol/L时A值差异有统计学意义(P<0.01);clpP缺陷株在0.2mmol/L时A值差异即有统计学意义(P<0.05),并且其值随铁螯合剂浓度的增加而减小。加入FeSO4培养24h,htrA缺陷株与标准株A值差异无统计学意义(P>0.05);clpP缺陷株的A值低于标准株(1.002±0.014 vs 1.325±0.010,P<0.05)。与标准株按1∶1比例混合培养24h,htrA缺陷株与其单独生长时的A值的差异无统计学意义(P>0.05);clpP缺陷株的A值高于其单独培养时的A值(10.878±0.005 vs 0.664±0.006),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 htrA和clpP基因分别在一定程度上影响变异链球菌的铁代谢。

变异链球菌clpP基因启动子的克隆及活性测定

目的克隆变异链球菌clpP基因启动子,并进行初步验证。方法 PCR分别扩增变异链球菌clpP基因5′-侧翼序列FclpP及其突变体FclpP-ΔRS,插入β-半乳糖苷酶(β-glucuronidase,gusA)报道基因表达载体pIB107 BamHI/XhoI酶切位点之间,构建clpP基因5′-侧翼序列及其突变体gusA报道基因表达载体pFclpP和pFclpP-ΔRS,PCR、酶切及测序鉴定;经Bgl II线性化后转化变异链球菌UA159,卡那霉素筛选阳性克隆,得到clpP基因5′-侧翼序列及其突变体gusA报道基因表达株SClpP和SClpP-ΔRS,经PCR及测序鉴定后,测定SClpP、SClpP-ΔRS、阳性对照SAmi和阴性对照SIB107的GusA活性。结果成功扩增出变异链球菌clpP基因5′-侧翼序列及其突变体;变异链球菌clpP基因gusA报道基因表达载体经PCR、酶切及测序鉴定正确无误;PCR及测序结果表明成功构建clpP基因5′-侧翼序列及其突变体变异链球菌gusA报道基因表达株SClpP和SClpP-ΔRS;GusA活性测定证实变异链球菌clpP基因5′-侧翼序列及其变体gusA报道基因表达株SClpP和SClpP-ΔRS的GusA活性分别是阴性对照pIB107的34.6和8.7倍,是阳性对照松鼠葡萄球菌ami基因启动子片段gusA报道基因表达株活性的5.2和1.3倍,提示插入片段FclpP和FclpP-ΔRS具有较强的启动子活性。结论成功定位并克隆变异链球菌clpP基因启动子,为今后研究clpP基因上游调控序列提供试验和理论依据。

黄瓜芽黄突变相关基因ClpP克隆及植物表达载体构建

为了获得黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列,研究其与黄瓜芽黄突变现象的关系,采用TRNzol法提取芽黄突变的黄瓜叶片总RNA,并以其为模板反转录合成cDNA第一链。根据NCBI预测的黄瓜ClpP基因序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增得到目的条带后测序,并构建植物表达载体;成功获得黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列,并提交到NCBI。该基因编码区全长495bp,共编码氨基酸158个。预测其理论等电点为5.22,理论蛋白质分子量为41.00356 KDa,编码的蛋白包含S14_ClpP_2保守结构域,无信号肽。通过与其他植物Clp蛋白酶的氨基酸序列比对发现与毛茛属植物的Clp蛋白酶同源性较高。并成功构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体pBI121-ClpP。黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列的获得说明该基因在黄瓜中确实存在,这是首次克隆得到了黄瓜中的ClpP基因的cDNA全序列。

htrA、clpP基因缺失对变异链球菌生长影响的初步观察

目的：研究htrA、clpP基因缺失对变异链球菌生长情况的影响。方法：采用浊度法测定变异链球菌标准株、htrA单基因缺陷株、clpP单基因缺陷株及htrA—clpP双基因缺陷株生长6h中每小时的吸光度，采用MTT实验测定4种菌株的不同时间甲臌吸光度变化情况并探究其与平板计数活菌量之间的关系。结果：在正常营养条件下，浊度法1．6h及MTr法2、4h及6h变异链球菌标准株的生长快于htrA、htrA—clpP缺陷株（P〈0．01）；浊度法1-6h及MTT法1-3hclpP缺陷株生长快于其他两种缺陷株（P〈0．01）；变异链球菌标准株、htrA缺陷株及htrA—clpP缺陷株1～4h、clpP缺陷株1-3h甲脱吸光度与活菌量呈正相关（r分别为0．860、0．761、0．790及0．773，P〈0．05或P〈0．01）。结论：htrA、clpP单独或同时缺失可抑制变异链球菌的生长，MTT实验可在一定时间和一定菌数范围内反映标准株与3种缺陷株的活菌数。

clpP基因对变异链球菌生长及氧化应激的影响

目的观察变异链球菌clpP基因缺陷株的生长特点;比较标准株与clpP基因缺陷株在氧化应激条件下的生长情况的差异。方法将两菌株分别培养在普通TPY液体培养基和含有H2O2终浓度0.0 005%的TPY培养基中,37℃微需氧条件下培养,从接种入培养基开始以2 h间隔采用酶联免疫检测仪在600 nm下测定各菌株的生长曲线并比较其生长情况的差异。结果①缺陷株在TPY液体培养基中生长时,生长周期发生改变,对数期峰值提前且此阶段生长速度较标准株快(P<0.05),而标准株的对数期峰值及稳定期A值均明显高于缺陷株(P<0.05);②标准株和缺陷株在含有H2O2的TPY液体培养基中生长时生长能力较无H2O2条件下明显降低(P<0.05)。结论 clpP基因的失活一定程度上导致变异链球菌生长能力和氧化应激能力的降低。

牙龈卟啉单胞菌FtsZ降解试验模型-clpP基因缺失株的构建

目的 建立牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZ （FtsZPg）体内降解试验模型,即构建蛋白酶编码基因clpP缺失的E.coli MG1655.方法 将一段两端含靶基因同源臂的PCR产物电转入L-阿拉伯糖诱导后表达λ噬菌体重组蛋白、具有较强重组能力、含质粒pKD46的菌株E.coli MG1655感受态细胞,以PCR产物中的氯霉素抗性基因替代靶基因.结果 利用氯霉素抗性平板筛选阳性重组体,得到E.coli MG1655的ClpP蛋白酶基因敲除突变株.通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序最终鉴定阳性clpP基因缺失株.结论 本试验成功构建了E.coli MG1655 clpP敲除株;该敲除株有望在探讨重要牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZPg与蛋白酶clpP的关系中发挥一定作用.

细菌ClpP蛋白酶功能及其抗菌药物靶点的研究进展

ClpP(Casein lytic proteinase P)是一种广泛存在于真核细胞和原核生物中的丝氨酸蛋白酶,可与多种类型AAA+(ATPase associated with various cellular activity)超家族ATP酶组成多种ClpP蛋白酶复合物,其主要功能是清除或降解细菌胞内合成不当、受损伤、变性聚集或无用的蛋白,并维持正常代谢和压力刺激下胞内蛋白质的动态平衡。近年研究表明,细菌ClpP可协助病原菌在宿主体内生存、繁殖和播散,ClpP在细菌致病过程中发挥重要作用,其相关致病机制也受到广泛关注。近年,细菌对抗生素耐药性不断增强,已严重威胁人类健康,ClpP蛋白酶因其独特的蛋白水解作用而成为抗菌药物研究的新靶点。本文综述了ClpP在不同病原体中的结构、分子功能和不同作用以及相应药物开发方面的研究进展。

一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白质水解酶PlclpP基因的克隆、表达和酶学特性

运用基因克隆技术,以分离鉴定获得的蛋白质水解酶高活性类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)CHN26菌株基因组DNA为模板,克隆鉴定了该菌株一种新型ATP-依赖型Clp P家族蛋白质水解酶Plclp P基因(585 bp),编码194个氨基酸,蛋白质分子量约为2.1×104。采用大肠杆菌(Eschericia coli)p ET表达系统,构建了Plclp P基因表达质粒p ET-28-Plclp P,并在大肠杆菌BL21中实现了重组Pl Clp P蛋白质的表达。利用组氨酸标签(His-tag)亲和纯化法,获得了Pl Clp P纯化蛋白质,发现Pl Clp P可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋白质复合物。Pl Clp P复合物具有ATP-依赖型酪蛋白水解酶活性,最适反应条件为40℃、p H7.0。表面活性剂强烈抑制Pl Clp P复合物的酶活,而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂对其活性无抑制作用。

牙龈卟啉单胞菌clpP基因缺失株和回补株的构建和鉴定

目的构建并鉴定牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)W83的丝氨酸蛋白酶(caseinolytic protease,Clp)基因缺失株和回补株,为探索clpP基因在P.g致病过程中的作用和机制奠定基础。方法设计clpP基因的引物对,PCR扩增其上下游同源片段,克隆入质粒pUC18中,插入红霉素抗性基因ermB作为筛选标记,构建重组质粒,电转化入P.g W83构建缺失株;PCR扩增clpP基因片段与重组质粒pUC18-ΔclpP-ermB连接,电转化入P.g W83缺失株中构建回补株。采用PCR和酶切电泳鉴定序列的正确性,利用抗性培养基筛选高表达菌株。结果 clpP基因克隆成功并顺利导入质粒pUC18中,P.g W83的clpP基因缺失株和回补株构建成功,并能在体外稳定传代。结论本研究运用同源重组技术构建了P.g W83的clpP基因缺失株,并建立了以pUC18质粒为载体的clpP基因回补方法,为进一步研究clpP基因在P.g致病过程中的作用打下了基础。