miR-182可以促进耳蜗前体细胞分化为毛细胞

目的探讨miR-182诱导耳蜗前体细胞向毛细胞分化的作用及机制。方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞并用血清诱导分化,BrdU、Nestin免疫荧光染色鉴定细胞自我增殖能力;myosinⅦa和phalloidin免疫荧光染色鉴定其是否具有分化为毛细胞的潜能。分别利用miR-182 mimics和siRNA在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miR-182,然后在细胞诱导分化7天后,用流式细胞仪检测分化细胞中myosinⅦa阳性细胞比例,用Western-blot检测支持细胞标志分子中Sox2的变化。结果使用miR-182 mimics进行过表达后,耳蜗前体细胞分化为myosinⅦa阳性表达的细胞比例显著高于对照组,使用miR-182 siRNA进行低表达后此比例显著低于对照组。Western-blot检测显示,Sox2在miR-182 mimics组较对照组降低,miR-182 siRNA组较对照组增加。结论过表达miRN182可以促进耳蜗前体细胞向毛细胞方向分化,ox2可能是此过程中的靶基因。

新生大鼠耳蜗前体细胞的培养及鉴定

目的对新生大鼠耳蜗前体细胞进行分离、培养和鉴定。方法从出生7天的大鼠耳蜗中分离、培养前体细胞,用免疫细胞化学的方法对前体细胞进行鉴定;血清诱导分化后鉴定分化潜能,进一步了解其多向分化特性。结果原代培养的细胞,培养1d后即可见"细胞球"。细胞球内大部分细胞呈nestin、musashi1、pax2和BrdU阳性,表明其具有自我更新及有丝分裂的能力。细胞球经诱导分化14d后,对分化细胞行免疫细胞化学鉴定,发现分化细胞表达毛细胞标志物myosin VIIA和phalloidin,表达成熟神经元标志物NeuN,表达不成熟神经元标志物Tuj1,表达星形胶质细胞标志物GFAP,表达少突胶质细胞标志物galactocerebroside,以及谷氨酸能神经元标志物GluR-1,证明其具有多向分化潜能。结论本实验证明耳蜗前体细胞具有神经干细胞的多向分化潜能,为研究通过基因治疗的方法促进耳蜗神经细胞增殖提供了一种体外模型。

内皮祖细胞在噪声性耳聋耳蜗损伤中的变化

目的探讨内皮祖细胞在噪声性耳聋耳蜗损伤中的变化。方法 50只SD大鼠分为两组,其中空白对照组10只,实验组40只。空白对照组不做处理,实验组进行噪声暴露构建噪声性耳聋动物模型,并按照暴露时间分为4组,分别为暴露后即刻组和暴露后1 d组、暴露后7 d组、暴露后14 d组,每组各10只。分别检测各组动物的外周血内皮祖细胞水平和血管内皮生长因子、诱导型一氧化氮合酶及CD34水平,并进行比较。结果暴露后即刻组和暴露后1 d组、暴露后7 d组的外周血内皮祖细胞水平均显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);但暴露后14 d组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。暴露后1 d组、暴露后7 d组的血管内皮生长因子表达水平均显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);但暴露后即刻组、暴露后14 d组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示:实验组噪声暴露后即刻、暴露后l d的CD34均呈微弱表达,噪声暴露后7 d呈强表达;噪声暴露后14 d呈阳性表达;噪声暴露后即刻的诱导型一氧化氮合酶呈微弱表达,暴露后1 d呈强表达,暴露后7、14 d组呈阳性表达。经扫描电镜结果显示:空白对照组动物的内耳内外毛细胞均呈现出整齐排列的情况,暴露后即刻组、暴露后1 d组可见内耳毛细胞呈现出紊乱状态,暴露后7 d组、暴露后14 d组,经观察动物耳蜗第二圈可见外毛细胞呈现出紊乱、缺失等现象。结论噪声性耳聋会导致耳蜗损伤的出现,内皮祖细胞数量会随着时间的变化发生改变,并在耳蜗损伤修复中发挥重要作用。

c—myc在大鼠耳蜗组织发育和耳蜗前体细胞分化过程中的表达变化

目的通过检测c—myc基因在大鼠耳蜗组织发育及前体细胞分化过程中的表达情况，探讨其在哺乳动物耳蜗发育中的作用。方法①取E10、E15、P1、P7和P14的SD大鼠耳蜗组织，应用RT--PCR、Western blot的方法检测c-myc在大鼠耳蜗组织发育过程中的表达情况。②取耳蜗前体细胞和分化7天后的分化细胞，用RT-PCR、免疫细胞化学染色和Western blot的方法检测c—myc在耳蜗前体细胞分化过程中的表达情况。结果从胚胎至出生后的耳蜗发育过程中，c-myc表达量呈现逐渐下降趋势；在前体细胞的分化过程中，c-myc的表达量也呈现下降趋势。结论c-myc可能参与调控大鼠耳蜗组织的发育及前体细胞的分化。

大鼠耳蜗前体细胞的体外培养与分化鉴定

目的 :分离、培养大鼠的耳蜗前体细胞,鉴定其增殖和分化能力,分析内耳发育相关基因在其分化中的表达。方法 :从新生大鼠的耳蜗组织中分离获得前体细胞,进行体外培养,并加入血清诱导分化,通过免疫细胞化学的方法鉴定其增殖和分化为毛细胞的能力,利用荧光定量PCR的方法分析不同分化阶段的耳蜗前体细胞中内耳发育相关基因的表达。结果:原代培养的耳蜗前体细胞经免疫细胞化学鉴定呈nestin、Brd U阳性,经血清诱导分化后呈myosinⅦA阳性。荧光定量PCR的结果表明Sox2、Cyclin A2在耳蜗前体细胞分化的过程中表达逐渐下降,而Jagged1在分化过程中表达不断升高。结论 :分离的耳蜗前体细胞具有增殖能力和分化为毛细胞的潜能,在其分化过程中Sox2、Cyclin A2和Jagged1可能参与调控大鼠前体细胞的分化和耳蜗组织的发育。

乙苯对CPCs细胞损伤及线粒体膜电位的影响

目的探讨乙苯对耳蜗前体细胞（CPCs）生长形态、增殖能力及线粒体膜电位（MMP）的影响，为乙苯导致听力损失的机制研究奠定基础。方法分离SPF级SD新生大鼠原代CPCs，荧光显微镜鉴定分离培养成功后，分为对照组和染毒组经不同浓度（0、15、30、45 μmol/L）的乙苯染毒24 h。采用倒置光学显微镜观察细胞损伤的形态学变化，MTT比色法检测细胞的增殖能力，荧光探针JC-1测定MMP的变化。结果大鼠CPCs的鉴定结果显示，肌球蛋白（Myosin）VIIa和内吞作用辅助蛋白（Epsin）表达阳性；与对照组相比，各染毒组大鼠CPCs的折光度增强，细胞死亡数目增多；与对照组相比，各染毒组的CPCs增殖能力明显降低并呈一定的剂量-效应关系，差异均有统计学意义（P〈0.05）；与对照组相比，各染毒组大鼠MMP明显降低，差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论乙苯可能导致大鼠CPCs发生损伤，细胞增殖抑制及MMP降低。