希金斯刺盘孢全基因组候选效应分子的预测

希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的十字花科植物炭疽病,影响作物品质并造成严重的经济损失。效应分子在植物病原真菌侵染寄主植物过程中发挥着重要的作用。根据已公布的希金斯刺盘孢的全基因组信息,以其全基因组蛋白序列为材料,通过生物信息学方法,对其候选效应分子及其功能进行了预测和分析。首先利用Signal P、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor和Target P程序依次预测出其分泌类型的蛋白,再通过其序列大小和半胱氨酸含量作进一步筛选,最后利用blastp工具与非冗余蛋白质数据库进行比对,找出数据库中没有蛋白同源性的序列,从而获得候选效应分子;同时对希金斯刺盘孢全基因组的16 150个蛋白序列进行分析,最终预测到135个符合条件的候选效应分子,而大多数都是功能未知的假定蛋白。本研究采用生物信息学分析方法预测出了希金斯刺盘孢的候选效应分子,为进一步研究这些效应分子的功能奠定了基础,其研究技术和手段也为其它真菌效应分子的预测提供了重要的参考资料。

菜心炭疽病菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响因素

研究了温度、pH值、光照、碳源、氮源和培养基种类对菜心 (BrassicaparachinensisBailey)炭疽病菌(ColletotrichumhigginsianumSacc .)菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响。结果表明 :菌丝生长和产孢的温度均为 8～ 35℃ ,最适温度均为 2 5℃ ;在 10～ 35℃范围内 ,病菌的分生孢子均可萌发 ,最适温度为 2 5℃ ;分生孢子的致死温度为 5 3℃ ,10min或 5 5℃ ,5min。病菌在pH 3 0～ 10 0均能生长及产孢 ,最适pH值均为 6 0。光照对菌丝的生长速率影响不大 ,但连续光照有利于菌丝干物质的积累和孢子量的增加。在被测试的 9种碳源中 ,菌丝生长速率以甘露醇、麦芽糖和葡萄糖为最快 ;菌丝干重以葡萄糖为最高 ;产孢量以麦芽糖为最多。在被测试的 9种氮源中 ,菌丝生长以甘氨酸为最好 ;菌丝干重以硝酸钾为最好 ,产孢量以尿素为最好。在被测试的 11种培养基中 ,菌丝生长以PDA和菜心榨汁PDA培养基为最好 ;

2009—2014年间广东省菜心炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性

为了解广东省菜心炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性差异和变化,于2009—2014年从广东省15个县/市菜心产区分离获得105个菜心炭疽病菌菌株,采用菌丝生长速率法测定了其对咪鲜胺的EC50值,并比较了同一年份不同地区菜心炭疽病菌菌株对咪鲜胺的敏感性差异和不同年份间菜心炭疽病菌菌株对咪鲜胺的敏感性变化。结果显示：同一年份菌株间,采自2009年间的菌株对咪鲜胺的敏感性差异最小,敏感性最低地区菌株的平均EC（50）值是最高地区菌株的1.2倍;采自2014年间的菌株对咪鲜胺的敏感性差异最大,敏感性最低地区菌株的平均EC50值是最高地区菌株的34.9倍;其余年份间的不同地区最大平均EC（50）值和最小平均EC50值相差9.2~10.4倍。不同年份菌株间,2010年的菌株对咪鲜胺的敏感性最高,平均EC（50）值为0.052 0μg/m L;2012年的菌株对咪鲜胺的敏感性最低,平均EC（50）值为0.259 9μg/m L;2012—2014年的菌株对咪鲜胺的平均EC（50）值范围在0.104 5~0.259 9μg/m L之间,高于2009—2011年的菌株对咪鲜胺的平均EC（50）值（0.052 0~0.074 3μg/m L）。2009—2014年广东省田间菜心炭疽病菌菌株对咪鲜胺的敏感性呈降低趋势,存在潜在抗药性风险。

硅对菜薹炭疽病防御反应中信号物质的影响

通过不同水平硅(Si)处理和接种炭疽病菌处理,研究Si对菜薹肌醇磷脂信号系统和钙调素信号系统的影响。结果表明:Si对磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰肌醇-4-磷酸(PIP)的形成有明显的调节作用。不同菜薹品种感染炭疽病后,PI消长明显不同,适宜水平Si处理下菜薹感病后可诱导形成较高水平的PI。菜薹感染炭疽病菌后,感病品种的中Si处理和抗病品种的低Si、中Si处理的PI呈明显增长趋势,而其它处理有消有长。感病品种在感病前期有抑制PIP产生的趋势,而后期转为促进作用,但抗病品种的变化规律与感病品种相反。抗病和感病品种在适宜水平Si处理下感染炭疽病菌后可明显提高PIP含量,特别是在感病后期更明显,这可能与PI后期大量降解,传递抗病信息有关。Si影响钙调素(CaM)含量,其影响程度与炭疽病菌的作用有关。低水平Si处理明显促进了炭疽病菌对感病品种CaM的诱导作用;中水平Si处理对抗病品种的诱导促进作用相对较强;感病品种的诱导促进作用比抗病品种明显。感病品种的中Si处理与抗病品种的低Si处理在感病后的CaM变化相对缓和。表明CaM参与炭疽病致病过程的调控。

转PcRS基因拟南芥的抗炭疽病研究

为确定虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)白藜芦醇合酶基因PcRS(Polygonum cuspidatum resveratrol synthase)提高植物抗病性的有效性,以转PcRS基因拟南芥为材料,对其进行了分子鉴定和抗炭疽病(Colletotrichum higginsianum)研究。利用Southern blot和Northern blot验证了外源PcRS基因在转基因拟南芥基因组中的整合和表达。对经过选育得到的T3代纯合株系进行离体的抗病性试验。转基因拟南芥甲醇提取物对炭疽病菌具有明显抑制作用。进一步采用点滴法接种生长4周的转基因拟南芥离体叶片,与野生型植株相比,转基因植株叶片坏死斑直径和坏死斑上的孢子数目都显著减少,表明转基因拟南芥通过抑制孢子的繁殖来限制炭疽病菌的定植,从而提高转基因植株对炭疽病的抗性。

希金斯炭疽菌效应子基因ChEP085的功能研究

希金斯炭疽菌是一种半活体营养型真菌,能够引起十字花科炭疽病,对华南地区的菜心产业造成了严重危害。病原菌分泌的效应子能够帮助病原菌侵入寄主植物,在病原菌与植物互作过程中起到重要作用。为探究希金斯炭疽菌效应子在十字花科炭疽病致病过程中的作用。基于华南农业大学热带亚热带真菌研究室前期的研究结果,筛选得到一个候选效应子ChEP085,该效应子在N端含有一段21个氨基酸的信号肽。为明确该效应子的功能,以希金斯炭疽菌侵染拟南芥Col-0的cDNA为模板,利用qRT-PCR技术测定了ChEP085基因的表达情况,发现ChEP085基因在侵染24 h后有最大表达量。利用农杆菌介导马铃薯X病毒烟草瞬时表达体系对ChEP085基因进行了验证,结果表明:该基因能够稳定诱导烟草细胞坏死。将ChEP085基因构建到增强型绿色荧光蛋白载体pBinceGFP上,在烟草上瞬时表达ChEP085基因进行亚细胞定位,发现该效应子同时定位于细胞质和细胞膜上。删除位于N端的信号肽后,瞬时表达的效应子ChEP085在细胞核、细胞膜和细胞质中均有分布,说明信号肽影响ChEP085的定位。最后利用同源重组技术敲除ChEP085基因,发现该基因的缺失对希金斯炭疽菌的菌落形态及菌丝生长速度均无明显影响,但会导致希金斯炭疽菌的孢子产量降低,致病力明显减弱,说明ChEP085在希金斯炭疽菌产孢及致病过程中均发挥重要作用。

13个菜心品种对菜心炭疽病的抗性鉴定

为了解广东省推广种植的菜心Brassica parachinensis品种对菜心炭疽病的抗性水平,对广东省13个具代表性菜心品种进行菜心炭疽病的抗性鉴定。结果显示,供试13个菜心品种对菜心炭疽病的平均病情指数为44.61~74.19,其中80天油青菜心的平均病情指数最低,粗苔49油青甜菜心的平均病情指数最高。80天油青菜心等6个品种对菜心炭疽病表现为中抗水平,粗苔49油青甜菜心等7个品种对菜心炭疽病表现为感病水平。目前在广东省生产种植的菜心以菜心炭疽病感病和中抗品种为主,缺乏菜心炭疽病抗性或高抗品种。

希金斯刺盘孢T-DNA插入突变体表型筛选及其特性分析

以希金斯刺盘孢菌株Ch-1为供试野生型菌株,通过农杆菌介导转化方法获得含2000个转化子的T-DNA插入突变体库,筛选菌落生长异常或致病缺陷突变体,分析致病缺陷突变体的T-DNA插入拷贝数和位点。结果显示,筛选到14株菌落异常突变体,包括2株生长缓慢突变体Ch-1-E393和Ch-1-C135、12株菌落形态异常突变体(包括色素异常、菌落扇变或菌丝坍塌现象),另外筛选到1株致病缺陷突变体Ch-1-G090。致病性测定结果表明,致病缺陷突变体Ch-1-G090接种拟南芥后,叶片发病明显减弱,且未产生水渍状病斑。显微观察发现该突变体分生孢子在叶片上仅能产生少量初生菌丝,不能正常形成次生菌丝。Southern杂交显示,致病缺陷突变体Ch-1-G090为T-DNA双拷贝插入;通过Inverse-PCR法获得插入T-DNA的侧翼序列,明确该突变体T-DNA插入位点分别为假定蛋白(Ch063_10682)和RNA加工蛋白FCF1(CH063_10671)编码区。

枯草芽胞杆菌HZB02的分离及其室内抑菌效果

从施用SupperGreen的小白菜‘凤山5号’根际土壤中分离筛选到1株对白菜炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)有较强拮抗活性的细菌菌株HZB02。该菌株对白菜炭疽病菌孢子萌发、菌丝生长、盆栽白菜发病等均有明显的抑制能力。根据菌落形态、菌体电镜观察及16SrDNA序列测定结果判断,该菌株属于Bacillus subtilis subsp.subtilis。进一步研究不同培养基条件及添加大豆油对HZB02抗生作用的影响,发现其在SYMA、PDA培养基上抑制炭疽病菌菌丝生长的能力最佳,此外其SYM、PDB发酵液对炭疽病菌孢子萌发的抑制作用亦最强,然而它的TSB发酵液则显示出最优抑制菌丝生长的效果。研究发现在SYM与PDB中添加5%大豆油的发酵液可显著提升HZB02的抑菌功效。

希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析

希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)是一种重要的植物病原真菌,可引起严重的十字花科蔬菜炭疽病,对蔬菜生产造成了很大的影响。为了探究希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26在致病过程中的作用,本研究以希金斯炭疽菌侵染拟南芥Col-0后的cDNA为模板,通过qRT-PCR技术测定了ChAtg26基因在侵染过程中的表达模式,并利用同源重组技术构建了ChAtg26基因的敲除与回补突变体,分析了敲除ChAtg26基因对希金斯炭疽菌生长发育与致病能力的影响。结果表明,ChAtg26基因在病菌侵染寄主后0~40 h中有较高的表达量,而敲除ChAtg26基因后,病菌在生长速率、孢子萌发、附着胞形成以及对氧化胁迫敏感性方面没有明显变化,但是会在菌落黑色素累积与对细胞壁胁迫的敏感性方面有所下降,同时其产孢量与致病力会明显降低,说明ChAtg26基因参与了希金斯炭疽菌的黑色素合成、细胞壁胁迫应答反应、产孢与致病过程,并在这些过程中起着重要作用。