环氧合酶-2反义寡核苷酸对鳞状细胞癌Colo-16细胞基质金属蛋白酶-2表达的影响

目的:研究环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AsODN)对人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞基质金属蛋白酶-2(metalloproteinase-2,MMP-2)表达的影响。方法:免疫细胞化学法检测Colo-16细胞中COX-2蛋白表达;免疫荧光显微镜观察转染情况;蛋白免疫印迹(Western blot)及半定量反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测Colo-16细胞MMP-2蛋白和MMP-2mRNA表达水平。结果:Colo-16细胞中COX-2蛋白阳性表达,并分布在胞质、胞核;Colo-16细胞胞质和胞核可见荧光标记的COX-2无义寡核苷酸、反义寡核苷酸;Western blot及RT-PCR检测结果显不COX-2反义寡核苷酸作用Colo-16细胞48 h后,MMP-2表达显著下调(P<0.05)。结论:COX-2反义寡核苷酸能有效下调Colo-16细胞MMP-2表达,提示COX-2反义寡核苷酸可能通过抑制MMP-2表达来阻断皮肤鳞状细胞癌的浸润、转移。

Caspase-3对5-ALA诱导鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡效应的影响

目的探讨半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)对光敏剂5-氨基酮戊酸(5-ALA)诱导鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡效应的影响。方法取对数生长期的Colo-16细胞用于实验,将细胞分为对照组、5-ALA-光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)组和Caspase-3抑制剂组(Z-DEVD-FMK),对照组不给予光敏剂和照光处理,5-ALA-PDT组给予0.4 mg/ml的5-ALA避光孵育4 h后,采用(功率密度10 m W/cm2,能量密度2.5 J/cm2)激光照射3 min,之后继续培养12 h。Caspase-3抑制剂组除孵育时同时加入Z-DEVD-FMK(终浓度40μmol),其余处理与5-ALA-PDT组相同。实验后收集各组细胞,通过免疫荧光观察各组细胞胞内Caspase-3荧光强度的变化,通过流式细胞术检测活性Caspase-3阳性细胞百分率和细胞凋亡率。结果免疫荧光结果发现对照组和Caspase-3抑制剂组Colo-16细胞胞浆中有微弱绿色荧光,表明Caspase-3表达量低,而5-ALA-PDT组中绿色荧光显著增强,表明其胞浆内Caspase-3含量显著增高。流式细胞仪的检测结果显示,对照组、5-ALA-PDT组和Caspase-3抑制剂组active-Caspase-3阳性细胞百分率分别为(2.26±0.16)%、(32.16±1.31)%和(3.36±0.31)%,5-ALA-PDT组高于对照组和Caspase-3抑制剂组,差异有统计学差异(P<0.05)。对照组、5-ALA-PDT组和Caspase-3抑制剂组的凋亡率分别为(2.35±0.22)%、(31.55±3.68)%和(11.46±2.25)%,三组之间两两比较,差异都有统计学意义(P<0.01)。结论 5-ALA-PDT可以诱导Colo-16细胞发生凋亡,且这种效应与caspase-3的激活密切相关。

雷帕霉素对Colo-16细胞系Stat3表达的影响

目的研究雷帕霉素对皮肤鳞状细胞癌Colo-16细胞系Stat3表达的影响。方法用不同浓度的雷帕霉素处理Colo-16细胞,Hoechst33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化;Western-blotting法检测Colo-16细胞Stat3,P-Stat3蛋白表达水平。结果雷帕霉素能够诱导Colo-16细胞凋亡,荧光染色可见细胞核染色质凝聚、核裂解的形态学改变;在雷帕霉素作用后Colo-16细胞Stat3,P-Stat3表达显著下调。结论雷帕霉素能诱导Colo-16细胞凋亡,其作用机制可能与Stat3表达下调有关。

消银解毒饮及拆方对角质形成细胞COLO-16增殖的调控作用

探讨消银解毒饮是否对角质形成细胞的增殖具有直接作用;以及消银解毒饮中凉血、解毒、祛风除湿等三组主要成分在治疗银屑病中所起的作用。本研究以角质形成细胞株COLO-16为研究对象;用四唑盐比色法观察了消银解毒饮及拆方后各组药物血清对COLO-16细胞增殖的影响。结果表明消银解毒组和凉血方组体外培养COLO-16细胞的存活率明显降低,而且存活率与含药血清浓度呈负相关。

消银解毒饮及拆方对角质形成细胞COLO-16凋亡的调控作用

本研究以角质形成细胞株COLO-16为研究对象,用流式细胞仪分析了消银解毒饮及其拆方后的凉血、解毒和祛风除湿等三组主要成份含药血清对其凋亡的诱导作用。结果表明消银解毒饮能诱导COLO-16细胞的凋亡,诱导角质形成细胞的凋亡可能是其治疗银屑病的机制之一。

他扎罗汀对Colo-16细胞体外增殖的影响及其机制的研究

目的:研究他扎罗汀对体外培养的皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞体外增殖的影响,并探讨其机制。方法:用不同浓度的他扎罗汀处理Colo-16细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定Colo-16细胞增殖活性;免疫组化染色技术及免疫印迹法分别测定Colo-16细胞Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果:不同浓度的他扎罗汀对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用,其抑制作用呈明显的时效和量效关系(P<0.05);他扎罗汀作用Colo-16细胞后,Bcl-2蛋白表达明显下调,Bax表达明显增强。结论:他扎罗汀能抑制皮肤鳞状细胞癌Colo-16细胞的增殖,其机制与Bcl-2蛋白表达下调和Bax表达增加有关。

COX-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞生长及c-myc基因表达的影响

目的探讨脂质体介导环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AsODN)对皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞生长及对c-myc表达的影响。方法将COX-2无义(Nonsense oligodeoxynucleotide,NsODN)、反义寡核苷酸用脂质体分别导入Colo-16细胞中。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察COX-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞体生长曲线的影响;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测c-myc蛋白表达的变化。结果COX-2反义寡核苷酸作用于Colo-16细胞后,细胞增殖能力受到抑制,荧光染色可见细胞核染色质边集、固缩、核碎裂的凋亡形态学改变;c-myc表达明显下调。结论COX-2反义寡核苷核酸能够抑制Colo-16细胞体外增殖,诱导Colo-16细胞凋亡,并能显著下调c-myc表达。

他扎罗汀体外诱导Colo-16细胞凋亡的研究

目的:研究他扎罗汀诱导体外培养的皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞的凋亡。方法:用不同浓度的他扎罗汀处理Colo-16细胞,流式细胞术检测Colo-16细胞早期凋亡率;Hoechst 33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化;印迹杂交法测定caspase 3蛋白表达水平;半定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)测定caspase 3 mRNA的表达。结果:他扎罗汀显著增加Colo-16细胞的早期凋亡,且Colo-16细胞早期凋亡率与他扎罗汀呈浓度依赖性(P<0.05);荧光染色可见细胞核染色质固缩、核破碎;活化的caspase 3表达显著增强,caspase 3 mRNA表达显著增强。结论:他扎罗汀在体外可诱导Colo-16细胞凋亡,caspase 3的活化参与此凋亡过程。

表皮生长因子受体特异性shRNA对Colo-16细胞凋亡的影响及其机制

目的探讨用特异性短发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达对鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法构建EGFR特异性shRNA表达载体并转染Colo-16细胞,Western blot检测细胞内EGFR,Akt及NF-κB的表达水平;流式细胞仪检测Colo-16细胞的凋亡变化。结果成功构建EGFR特异性shRNA表达载体并转染Colo-16细胞。转染特异性shRNA后,Colo-16细胞EGFR表达量的灰度值为0.42±0.03,与正常对照组(0.94±0.06)相比降低了55.57%,其差异具有统计学意义(P<0.05)。流式分析显示,下调EGFR表达可诱导Colo-16细胞凋亡,其凋亡率为12.65%,与对照组[凋亡率(0.11±0.03)%,(1.86±0.38)%和(2.26±0.25)%]比较差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,抑制EGFR表达还下调了PI3K/AKT信号通路蛋白Akt和NF-κB的表达。结论用特异性shRNA抑制EGFR表达可能是一种有潜力的抗皮肤鳞癌的治疗策略。

依维莫司对顺铂产生抗人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞效应的增效作用研究

目的探讨依维莫司是否增加顺铂对人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞的杀伤效应。方法分别用50、100、200nmol／L的依维莫司和25μmol／L顺铂处理人皮肤鳞状细胞癌系COLO-16细胞12、24h，用AO标记自噬体囊泡并结合溶酶体酶抑制剂分析自噬和自噬流水平。Western印迹分析自噬标记性分子LC3．Ⅰ→LC3-Ⅱ转化、Caspase3和PARP剪切；LDH释放实验分析细胞死亡；AnnexinV．EGFP染色分析细胞凋亡。结果50、100、200nmol／L的依维莫司处理COLO．16细胞后，12hLC3．Ⅰ→Lc3-Ⅱ转换值分别为3．52±0．21、4．03±0．39、5．05±0．22，两两之间比较，差异无统计学意义（P〉0．05），与未用药物处理的对照组（2．07±0．05）比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。24hLC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转换值分别为3．38±0．26、3．29±0．06、6．57±0．16，两两之间比较，差异无统计学意义（P〉0．05），与对照组（2．61％±0．16％）比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。50、100、200nmol／L的依维莫司联合E64d、pepstatin处理COLO-16细胞12h后，LC3-Ⅱ与B肌动蛋白的比值分别为1．26±0．40、1．16±0．34、1．21±0．39，与E64d、pepstatin单独处理细胞组（1．19±0．27）比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。100nmol／L依维莫司联合E64d、pepstatin自噬体囊泡表达阳性率2．06-4-0．61，与E64d、pepstatin单独处理细胞组（1．68±0．62）比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。依维莫司与顺铂联合处理24h细胞死亡率42．58％±0．93％，高于顺铂单独处理的细胞（死亡率18．20％±1．46％），差异有统计学意义。依维莫司联合顺铂处理与顺铂单独处理细胞相比，Caspase3和PARP剪切、AnnexinV标记细胞数以及LC3-Ⅱ形成均无统计学差异（P〉0．05）。结论依维莫司增强顺铂诱导COLO-1细胞死亡，这种效应不依赖于凋亡和自噬调控。

西罗莫司体外诱导Colo-16细胞凋亡的研究

目的研究西罗莫司对体外培养的皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞凋亡的影响。方法用不同浓度的西罗莫司处理Colo-16细胞，以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测西罗莫司对Colo-16细胞体外增殖的影响；AnnexinV-FITC和PI双染检测Colo-16细胞凋亡率；Hoechst33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化；半定量逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）测定Bcl-2、Bax mRNA的表达。结果不同浓度的西罗莫司对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用，这种抑制作用与西罗莫司的作用时间和剂量呈明显的依赖关系（P〈0．05）。西罗莫司显著增加Colo-16细胞的早期凋亡，西罗莫司（50，100，150，200nmol/L）作用48h后诱导Colo-16细胞的早期凋亡率分别为7．26％±0．26％、8．34％±0．19％、9．86％±0．14％、11．92％±0．15％，与对照组1．53％±0．09％比较，差异有统计学意义（P〈0．05），且Colo-16细胞早期凋亡率与西罗莫司浓度呈剂量依赖关系（r=0．955，P=0．000）。荧光染色可见细胞核染色质凝聚、边集、核裂解的形态学改变；Bcl-2 mRNA表达显著下调而Bax mRNA的表达显著增强。结论西罗莫司在体外能诱导Colo-16细胞凋亡，其发生机制可能与其调节Bcl-2、Bax等凋亡调控基因的表达有关。

依维莫司与顺铂协同损伤人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞机制的初步研究

目的探讨依维莫司与顺铂联合损伤人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞的分子机制。方法 依维莫司处理细胞后的信号通路实验分为对照组、50、100、200 nmol/L依维莫司处理组4组。依维莫司与顺铂联合处理的机制实验分为对照组、50 nmol/L依维莫司、25 μmol/L顺铂、50 nmol/L依维莫司 ＋ 25 μmol/L顺铂处理细胞组4组。通过Western印迹进行mTOR、Akt、DNA损伤相关信号以及Chk通路分析。结果 50、100、200 nmol/L依维莫司处理COLO-16细胞12、24 h后，mTOR 2448位点和2481位点的磷酸化水平降低，Rictor 1135位点磷酸化水平也降低。然而，下游信号ULK1蛋白的ser757位点的磷酸化水平、P70 S6激酶的thr389位点的磷酸化水平以及PKCα的thr638/641位点磷酸化水平的变化并不显著。依维莫司处理对Akt的总蛋白水平和磷酸化水平无明显影响。顺铂处理COLO-16细胞12、24 h后，Rictor的thr1135位点磷酸化水平和Chk1的ser345位点磷酸化水平明显升高，但依维莫司单独处理无类似效应。当依维莫司与顺铂联合处理后12和24 h，相对于顺铂单独处理的细胞，上调的Chk1和Rictor磷酸化水平受到明显抑制。结论 COLO-16细胞mTOR信号对依维莫司处理敏感，但其下游信号并非同步产生级联反应。依维莫司可能通过抑制检测点激酶1的激活增强顺铂诱导COLO-16细胞死亡，但无加重顺铂所导致的DNA损伤。

环氧合酶-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞增殖及环氧合酶-2表达的影响

目的研究环氧合酶（COX）-2反义寡核苷酸（AsODN）对人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞体外增殖的抑制作用及COX一2表达的影响。方法人工合成COX-2AsODN，利用脂质体将不同浓度（50，100，200，400nmol／L）反义寡核苷酸转染入Colo-16细胞，免疫荧光显微镜观察转染情况；采用噻唑蓝（MTT）法检On,4Colo-16细胞的增殖情况；Western印迹及半定量逆转录PCR检测Colo-16细胞COX-2蛋白和mRNA表达水平。结果不同浓度的COX-2AsODN对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用（P〈0．05），400nmol／L反义组在48h抑制率最高，达60．3％；COX-2AsODN转染Colo-16细胞后，COX-2蛋白和mRNA表达明显下调，50、100、200、400nmol／L组COX-2蛋白灰度值分别为0．763±0．070、0．600±0．065、0．430±O．074、0．251±0．045，与阴性对照组相比差异均有统计学意义（P〈0．05）；COX-2mRNA表达量随COX-2AsODN浓度的增加而减少，50、100、200、400nmol／L组COX-2mRNA灰度值分别是0．778±0．025、0．602±0．041、0．417±0．031、0．297±0．051，各组间COX一2mRNA表达差异有统计学意义（F：132．48，P〈0．01）。结论COX-2AsODN对Colo-16细胞的体外增殖有抑制作用，并能下调COX-2蛋白及其mRNA在Colo-16细胞中的表达，提示COX-2AsODN有潜在治疗皮肤鳞状细胞癌的作用。

大黄酸对colo—16细胞线粒体的作用

大黄蒽醌衍生物对移植肿瘤,肝癌细胞和肺癌细胞等DNA模板功能和线粒体的影响已有许多研究报道,但对人表皮角质形成细胞colo-16线粒体改变的研究尚未见报道。因此本研究旨在探讨大黄蒽醌衍生物之一大黄酸对体外培养的colo-16细胞线粒体的影响,进一步探讨大黄酸抑制细胞增殖的药理作用。1 材料与方法1.1 材料 人表皮角质形成细胞株colo-16,是一鳞癌细胞株,由美国内尔大学医学院Elkon教授惠赠。大黄酸标准品(纯度为100%),由北京医科大学郑俊华教授提供。主要培养基是RPMI1640,细胞线粒体染色剂为罗达明6G;用MPV-型显微细胞荧光光度仪检测。1.

超抗原对银屑病患者外周血单一核细胞和Colo 16细胞株的细胞动力学影响

目的:探讨超抗原在银屑病发病中的作用。方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法和酶联免疫吸附试验(ELISA),检测进行期寻常型银屑病患者和正常对照外周血单一核细胞(PBMC)和角质形成细胞Colo 16细胞株经葡萄球菌肠毒素B(SEB)体外刺激48 h的细胞增殖和凋亡。结果:进行期寻常型银屑病患者和正常人PBMC经SEB刺激,其细胞增殖和凋亡与空白组比较差异有显著性(P<0.01);角质形成细胞(Colo 16细胞株经SEB刺激,其细胞增殖和凋亡与空白组比较差异无显著性(P>0.05)。结论:超抗原可能是通过刺激PBMC的活化,引发银屑病皮损的发生,而对角质形成细胞没有直接作用。超抗原活化的PBMC迅速进入凋亡,提示超抗原刺激PBMC活化增殖和凋亡是自身稳定的调控,使PBMC数量和质量恢复正常。

三氧化二砷诱导人鳞状细胞癌细胞凋亡的研究

目的:研究三氧化二砷(arsenictrioxide,As2O3)诱导人鳞状细胞癌细胞系Colo-16细胞凋亡,探讨As2O3对鳞状细胞癌的临床应用意义。方法:应用MTT分析、流式细胞仪分析和DNA凝胶电泳分析等实验方法,观察了As2O3诱导人鳞状细胞癌细系Colo-16细胞凋亡过程。结果:As2O3能同时诱导Colo-16细胞凋亡和坏死,并且具有浓度和时间依赖性。结论:As2O3可以诱导鳞癌细胞系Colo-16细胞凋亡,抑制细胞增生活跃,并有时间和浓度的依赖性。

银屑灵对PCNA表达和角质形成细胞凋亡的影响

目的观察银屑灵对小鼠阴道上皮核细胞增殖抗原(PCNA)表达和角质形成细胞COLO-16凋亡的影响。方法70只雌性昆明小鼠,随机分为7组,银屑灵大中小剂量组、甲氨喋呤(MTX)组、迪银片组、生理盐水组和空白对照组,除空白对照组外,其余各组分别同时雌激素化3d后给药,连续给予受试药6d,每天2次,末次给药后6h后处死小鼠,光镜下观察小鼠阴道上皮PCNA表达的情况。另将COLO-16传代,二氧化碳培养箱中培养,将已长满瓶壁的COLO-16分为4组:对照组及不同浓度的银屑灵组,培养24h后用流式细胞仪检测角质形成细胞的凋亡情况。结果银屑灵大中小剂量组、MTX组和迪银片组对小鼠阴道上皮PCNA表达均有抑制作用,各组均优于生理盐水组及空白对照组,其中尤以银屑灵大剂量组作用更显著。银屑灵的药液浓度越高,对COLO-16凋亡的影响就越明显。结论银屑灵对小鼠阴道上皮PCNA表达的抑制作用和对角质形成细胞COLO-16凋亡的影响可能是其治疗银屑病的作用机制之一。

紫草素对角质形成细胞株增殖的抑制及凋亡的作用

目的 : 探讨紫草素对角质形成细胞株colo - 16增殖及凋亡的调节作用。方法 : 利用体外细胞培养技术、MTT法、流式细胞仪、荧光显微镜技术检测不同浓度的紫草素对colo- 16细胞株增殖及凋亡的影响。结果 : 紫草素对colo - 16细胞株的作用与浓度及时间呈一定的关系 ,浓度越高 ,时间越长 ,其抑制作用越强。终浓度为 0 .2 5 μg ml、0 .5 μg ml的紫草素 ,培养 4 8h后 ,细胞的凋亡率分别为 9.89%、2 5 .0 4 % ,正常对照组为 5 .86 % ,两者相比差异显著。结论

愈银方含药血清对角质形成细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨愈银方对角质形成细胞株COLO-16增殖及凋亡的调节作用。方法:利用体外细胞培养技术、MTT法、流式细胞仪、荧光显微镜技术检测愈银方的大鼠含药血清对COLO-16细胞株增殖及凋亡的影响。结果:愈银方含药血清对COLO-16细胞株增殖的抑制作用与浓度呈一定的关系,浓度越高则抑制作用越强。含药血清的浓度为10%、20%;设相应的正常大鼠血清浓度为对照组,培养48h后,COLO-16细胞的凋亡率分别为12.93%、19.80%,正常对照组为3.71%、10.96%,两者相比差异显著。结论:抑制COLO-16细胞株的增殖及诱导其凋亡可能是愈银方治疗银屑病的机理之一。